论文目录 | |
| 致谢 | 第1-7页 |
| 摘要 | 第7-10页 |
| Abstract | 第10-19页 |
| 1 文献综述 | 第19-40页 |
| 1.1 手性化合物简介 | 第19-20页 |
| 1.2 手性邻二醇 | 第20-25页 |
| 1.2.1 手性邻二醇简介 | 第20页 |
| 1.2.2 手性芳基邻二醇简介 | 第20-22页 |
| 1.2.3 手性芳基邻二醇的合成 | 第22-25页 |
| 1.3 不对称羟醛缩合反应 | 第25-27页 |
| 1.3.1 不对称羟醛缩合反应简介 | 第25-26页 |
| 1.3.2 酶促不对称羟醛缩合反应 | 第26-27页 |
| 1.4 醛缩酶 | 第27-33页 |
| 1.4.1 醛缩酶简介 | 第27页 |
| 1.4.2 醛缩酶催化机理与分类 | 第27-28页 |
| 1.4.3 D-果糖-6-磷酸醛缩酶A | 第28-33页 |
| 1.5 酶分子改造 | 第33-35页 |
| 1.5.1 定向进化 | 第34页 |
| 1.5.2 半理性设计 | 第34页 |
| 1.5.3 理性设计 | 第34-35页 |
| 1.6 分子模拟 | 第35-38页 |
| 1.6.1 量子力学模拟 | 第36页 |
| 1.6.2 分子力学模拟 | 第36-37页 |
| 1.6.3 分子动力学模拟 | 第37页 |
| 1.6.4 分子对接 | 第37-38页 |
| 1.7 本课题研究的意义及内容 | 第38-40页 |
| 2 醛缩酶库的构建和筛选 | 第40-59页 |
| 2.1 引言 | 第40-41页 |
| 2.2 实验材料与方法 | 第41-48页 |
| 2.2.1 菌株与质粒 | 第41页 |
| 2.2.2 工具酶及试剂 | 第41-42页 |
| 2.2.3 实验所需培养基 | 第42页 |
| 2.2.4 培养条件 | 第42-43页 |
| 2.2.5 主要仪器 | 第43页 |
| 2.2.6 基因组的提取 | 第43页 |
| 2.2.7 醛缩酶基因的扩增及重组质粒的构建 | 第43-45页 |
| 2.2.8 大肠杆菌BL21(DE3)感受态的制备及转化 | 第45-46页 |
| 2.2.9 重组子的鉴定与表达 | 第46页 |
| 2.2.10 醛缩酶基因的诱导表达条件探索 | 第46-47页 |
| 2.2.11 分析方法 | 第47页 |
| 2.2.12 醛缩酶催化活力筛选 | 第47-48页 |
| 2.3 实验结果与讨论 | 第48-58页 |
| 2.3.1 目的基因的扩增和克隆 | 第48-52页 |
| 2.3.2 目标蛋白的可溶性表达 | 第52-56页 |
| 2.3.3 醛缩酶催化活力筛选 | 第56-58页 |
| 2.4 本章小结 | 第58-59页 |
| 3 D-果糖-6-磷酸醛缩酶A/B(FSAA/FSAB)的酶学性质表征及相关产物的鉴定 | 第59-77页 |
| 3.1 引言 | 第59-60页 |
| 3.2 实验材料与方法 | 第60-67页 |
| 3.2.1 实验材料与试剂 | 第60页 |
| 3.2.2 主要仪器 | 第60-61页 |
| 3.2.3 重组蛋白的诱导及表达 | 第61页 |
| 3.2.4 分析方法 | 第61页 |
| 3.2.5 肉桂醛和羟基丙酮(HA)间羟醛缩合反应消旋产物的制备 | 第61-62页 |
| 3.2.6 自发反应的检测 | 第62-63页 |
| 3.2.7 D-果糖-6-磷酸醛缩酶A/B(FSAA/FSAB)表达条件再优化 | 第63页 |
| 3.2.8 重组蛋白的纯化 | 第63-64页 |
| 3.2.9 催化性质表征 | 第64页 |
| 3.2.10 FSAA全细胞催化肉桂醛与HA间羟醛缩合反应 | 第64-65页 |
| 3.2.11 酶促产物的环化 | 第65页 |
| 3.2.12 电子圆二色谱(Electronic circular dichroism simulation, ECD)模拟 | 第65-66页 |
| 3.2.13 催化活力检测 | 第66-67页 |
| 3.3 实验结果与讨论 | 第67-75页 |
| 3.3.1 合成产物的表征 | 第67页 |
| 3.3.2 肉桂醛与羟基丙酮(HA)间自发羟醛缩合反应 | 第67-68页 |
| 3.3.3 D-果糖-6-磷酸醛缩酶A/B(FSAA/FSAB)的表达与纯化 | 第68-70页 |
| 3.3.4 D-果糖-6-磷酸醛缩酶A/B(FSAA/FSAB)催化条件优化 | 第70-73页 |
| 3.3.5 酶促产物绝对构型确认 | 第73-75页 |
| 3.3.6 D-果糖-6-磷酸醛缩酶A不对称催化肉桂醛与HA间羟醛缩合反应 | 第75页 |
| 3.4 本章小结 | 第75-77页 |
| 4 理性设计FSAA以提高其对肉桂醛类似物和HA的催化活力 | 第77-102页 |
| 4.1 引言 | 第77-78页 |
| 4.2 实验材料与方法 | 第78-87页 |
| 4.2.1 实验材料与试剂 | 第78-79页 |
| 4.2.2 主要仪器 | 第79页 |
| 4.2.3 重组细胞的培养、诱导及表达 | 第79页 |
| 4.2.4 FSAA催化的羟醛缩合反应 | 第79-80页 |
| 4.2.5 合成产物的表征 | 第80页 |
| 4.2.6 分子对接 | 第80-81页 |
| 4.2.7 突变体的构建 | 第81-83页 |
| 4.2.8 阳性克隆培养、目标蛋白表达与纯化 | 第83页 |
| 4.2.9 FSAA酶活测定 | 第83-84页 |
| 4.2.10 针对天然底物的酶活测定 | 第84页 |
| 4.2.11 表观动力学参数的测定 | 第84-85页 |
| 4.2.12 分析方法 | 第85页 |
| 4.2.13 蛋白-配体复合物构建 | 第85-86页 |
| 4.2.14 分子动力学模拟 | 第86-87页 |
| 4.2.15 分子动力学模拟结果分析 | 第87页 |
| 4.2.16 重组大肠杆菌全细胞催化羟醛缩合反应 | 第87页 |
| 4.3 实验结果与讨论 | 第87-100页 |
| 4.3.1 合成产物的结构鉴定 | 第87-88页 |
| 4.3.2 突变位点的确定及突变体的构建 | 第88-90页 |
| 4.3.3 FSAA野生型及突变体活力初筛 | 第90-93页 |
| 4.3.4 FSAA野生型及突变体活力复筛 | 第93页 |
| 4.3.5 FSAA野生型及部分突变体催化天然底物的活力分析 | 第93-94页 |
| 4.3.6 表观动力学参数分析 | 第94-95页 |
| 4.3.7 FSAA的分子模拟及能量计算 | 第95-99页 |
| 4.3.8 全细胞催化 | 第99-100页 |
| 4.4 本章小结 | 第100-102页 |
| 5 协同调控FSAA亚基内及亚基间相互作用以提高其对杂环芳香醛的催化活力 | 第102-122页 |
| 5.1 引言 | 第102-103页 |
| 5.2 实验材料与方法 | 第103-110页 |
| 5.2.1 实验材料与试剂 | 第103-104页 |
| 5.2.2 主要仪器 | 第104页 |
| 5.2.3 重组细胞的培养、诱导及表达 | 第104页 |
| 5.2.4 噻吩类杂环醛与羟基丙酮间羟醛缩合产物3a-3e的制备 | 第104-105页 |
| 5.2.5 突变体构建 | 第105-106页 |
| 5.2.6 阳性克隆培养、目标蛋白表达和纯化 | 第106页 |
| 5.2.7 酶活测定 | 第106-107页 |
| 5.2.8 表观动力学常数的测定 | 第107-108页 |
| 5.2.9 分析方法 | 第108页 |
| 5.2.10 蛋白-配体复合物构建 | 第108-109页 |
| 5.2.11 分子动力学模拟 | 第109页 |
| 5.2.12 重组大肠杆菌全细胞催化杂环芳香醛与HA间羟醛缩合反应 | 第109-110页 |
| 5.3 实验结果与讨论 | 第110-121页 |
| 5.3.1 合成产物的分离鉴定 | 第110页 |
| 5.3.2 突变位点的确定与构建 | 第110-112页 |
| 5.3.3 突变体活力测定及组合突变体的构建 | 第112-115页 |
| 5.3.4 分子动力学模拟及动力学常数分析 | 第115-119页 |
| 5.3.5 立体选择性分析 | 第119-120页 |
| 5.3.6 全细胞催化 | 第120-121页 |
| 5.4 本章小结 | 第121-122页 |
| 6 结论与展望 | 第122-124页 |
| 参考文献 | 第124-134页 |
| 附录 | 第134-157页 |
| 作者简介 | 第157页 |
