论文目录 | |
| 目录 | 第1-8页 |
| 中文摘要 | 第8-11页 |
| ABSTRACT | 第11-13页 |
| 第1章 绪论 | 第16-49页 |
| 1.1 植物生物质结构的复杂性及其抗降解屏障研究进展 | 第16-26页 |
| 1.1.1 纤维素的合成及结构 | 第18-22页 |
| 1.1.2 半纤维素与胶质多糖的合成与结构 | 第22-24页 |
| 1.1.3 木质素的结构及对其分析的挑战 | 第24-25页 |
| 1.1.4 木质纤维素生物质的抗降解屏障 | 第25-26页 |
| 1.2 宏基因组学研究进展与生物质降解的主要微生物及主要酶系统 | 第26-35页 |
| 1.2.1 宏基因组学研究进展 | 第27-28页 |
| 1.2.2 生物质降解的主要微生物群落 | 第28-29页 |
| 1.2.3 糖苷水解酶的多样性及其结构、功能特征 | 第29-31页 |
| 1.2.4 纤维素酶的分类与其拓扑结构的保守性 | 第31-34页 |
| 1.2.5 高效降解生物质的纤维素酶系统 | 第34页 |
| 1.2.6 纤维素降解酶系的协同作用 | 第34-35页 |
| 1.3 纤维素酶的多功能性及其活性架构相关研究进展 | 第35-47页 |
| 1.3.1 纤维素酶的底物特异性及其多功能性 | 第35-37页 |
| 1.3.2 糖苷水解酶GH12家族的多功能性 | 第37-39页 |
| 1.3.3 基因序列的自动功能注释 | 第39-40页 |
| 1.3.4 提高自动功能注释的准确度 | 第40-43页 |
| 1.3.5 纤维素酶的工程化改造 | 第43-44页 |
| 1.3.6 纤维素酶的性质表征 | 第44-45页 |
| 1.3.7 计算模拟在生物质降解转化研究中的应用 | 第45-46页 |
| 1.3.8 糖苷水解酶自动功能注释与其多功能活性架构间的科学问题 | 第46-47页 |
| 1.4 立题依据 | 第47-49页 |
| 第2章 快速表征糖苷水解酶酶学性质的电泳技术的建立 | 第49-71页 |
| 2.1 材料和方法 | 第49-55页 |
| 2.1.1 菌株 | 第49-50页 |
| 2.1.2 主要试剂 | 第50页 |
| 2.1.3 主要仪器设备 | 第50-51页 |
| 2.1.4 菌体培养与粗酶液制备 | 第51页 |
| 2.1.5 蛋白浓度和酶活力的测定 | 第51-52页 |
| 2.1.6 SDS-PAGE | 第52页 |
| 2.1.7 原位展示糖苷水解酶活性的电泳技术 | 第52-53页 |
| 2.1.8 电泳条带迁移率与灰度值的定量提取与数据分析 | 第53-54页 |
| 2.1.9 原位展示糖苷水解酶pH性质的活性电泳技术 | 第54页 |
| 2.1.10 原位展示糖苷水解酶温度稳定性的活性电泳技术 | 第54页 |
| 2.1.11 分析糖苷水解酶与底物结合力的亲和电泳技术 | 第54-55页 |
| 2.2 结果与分析 | 第55-67页 |
| 2.2.1 电泳条带灰度值可定量表征蛋白质浓度或酶组分的相对活力 | 第55-57页 |
| 2.2.2 不同糖苷水解酶组分相对比酶活力的快速定量分析 | 第57-58页 |
| 2.2.3 外切纤维素酶组分活力的快速定量分析 | 第58-60页 |
| 2.2.4 糖苷水解酶pH性质的快速定量分析 | 第60-64页 |
| 2.2.5 糖苷水解酶温度稳定性的快速定量分析 | 第64-65页 |
| 2.2.6 糖苷水解酶结合力的快速定量分析 | 第65-67页 |
| 2.3 讨论 | 第67-70页 |
| 2.3.1 活性电泳表征糖苷水解酶学性质的可能影响因素 | 第67-68页 |
| 2.3.2 活性电泳表征糖苷水解酶活性与其酶活力测定间的对应关系 | 第68-70页 |
| 小结 | 第70-71页 |
| 第3章 糖苷水解酶GH12家族系统发育及其多功能性决定位点的生物信息学分析 | 第71-88页 |
| 3.1 材料和方法 | 第71-74页 |
| 3.1.1 生物信息学数据库 | 第71-72页 |
| 3.1.2 应用软件及其版本 | 第72页 |
| 3.1.3 基于序列比对构建GH12家族的系统发育树 | 第72-73页 |
| 3.1.4 GH12家族酶分子的三维结构及其表面电势分析 | 第73页 |
| 3.1.5 GH12家族酶分子的同源模建及结构比对 | 第73页 |
| 3.1.6 GH12家族活性中心序列谱的绘制 | 第73页 |
| 3.1.7 活性中心序列谱的稳定性及其统计检验 | 第73-74页 |
| 3.2 结果与分析 | 第71-86页 |
| 3.2.1 基于序列比对生成的GH12家族系统发育树 | 第74-75页 |
| 3.2.2 GH12家族酶分子的基本结构特征 | 第75-77页 |
| 3.2.3 GH12家族酶分子的表面电势分析 | 第77-79页 |
| 3.2.4 GH12家族酶分子的结构比对 | 第79-80页 |
| 3.2.5 GH12家族活性中心序列谱 | 第80-81页 |
| 3.2.6 GH12家族活性中心序列谱的consurf统计检验 | 第81-82页 |
| 3.2.7 GH12家族的活性架构 | 第82-83页 |
| 3.2.8 活性中心序列谱中主要位点的功能预测分析 | 第83-86页 |
| 3.3 讨论 | 第86页 |
| 小结 | 第86-88页 |
| 第4章 GH12家族代表性酶分子的异源表达与定点突破 | 第88-114页 |
| 4.1 材料和方法 | 第88-102页 |
| 4.1.1 菌株和质粒 | 第88页 |
| 4.1.2 培养基 | 第88-89页 |
| 4.1.3 工具酶与试剂盒 | 第89-90页 |
| 4.1.4 主要仪器 | 第90页 |
| 4.1.5 菌株的活化与培养 | 第90-91页 |
| 4.1.6 基因克隆与重组质粒的构建 | 第91-93页 |
| 4.1.7 以大肠杆菌为宿主的原核表达体系的建立 | 第93-94页 |
| 4.1.8 以酿酒酵母为宿主的真核表达系统的建立 | 第94-95页 |
| 4.1.9 以毕赤酵母为宿主的真核表达系统的建立 | 第95-99页 |
| 4.1.10 EGⅢ/EglA最适反应温度的测定 | 第99页 |
| 4.1.11 EGⅢ/EglA最适反应pH的测定 | 第99页 |
| 4.1.12 定点突变技术的建立 | 第99-101页 |
| 4.1.13 突变体蛋白的表达和纯化 | 第101-102页 |
| 4.2 结果和分析 | 第102-112页 |
| 4.2.1 基因克隆与重组质粒的构建 | 第102页 |
| 4.2.2 外源基因在大肠杆菌中的诱导表达 | 第102-103页 |
| 4.2.3 大肠杆菌表达目标蛋白的分离纯化及其活性的电泳检测 | 第103-104页 |
| 4.2.4 酿酒酵母表达异源蛋白的探索尝试 | 第104-105页 |
| 4.2.5 毕赤酵母本源表达的相关纤维素酶类 | 第105-107页 |
| 4.2.6 EGⅢ和EglA的分离纯化及其去糖基化研究 | 第107-109页 |
| 4.2.7 EGⅢ/EglA最适反应温度的测定 | 第109页 |
| 4.2.8 EGⅢ/EglA最适反应pH的测定 | 第109-110页 |
| 4.2.9 重叠延伸PCR定点突变技术的建立 | 第110-111页 |
| 4.2.10 直接对环状质粒进行的定点突变技术的建立 | 第111-112页 |
| 4.3 讨论 | 第112-113页 |
| 小结 | 第113-114页 |
| 第5章 酶分子活性架构中关键氨基酸残基的突变与多功能性的机理分析 | 第114-139页 |
| 5.1 材料与方法 | 第114-120页 |
| 5.1.1 主要试剂 | 第114页 |
| 5.1.2 主要仪器 | 第114-115页 |
| 5.1.3 主要软件及版本 | 第115页 |
| 5.1.4 蛋白浓度和酶活力的测定 | 第115-116页 |
| 5.1.5 酶分子二级结构的测定 | 第116页 |
| 5.1.6 酶分子催化动力学常数K_m与K_(cat)的测定 | 第116-117页 |
| 5.1.7 荧光辅助糖电泳(FACE)分析酶解产物谱的动态变化 | 第117-118页 |
| 5.1.8 酶分子与底物结合过程中热力学常数的测定 | 第118-120页 |
| 5.1.9 第22位氨基酸与葡萄糖结合能的理论计算 | 第120页 |
| 5.2 结果与分析 | 第120-134页 |
| 5.2.1 GH12家族活性架构中保守催化残基及其催化机理的验证 | 第120-121页 |
| 5.2.2 活性架构中第95位氨基酸残基突变对酶活力的影响 | 第121-123页 |
| 5.2.3 活性架构中第22位氨基酸残基系列突变对酶活力的影响 | 第123-126页 |
| 5.2.4 活性架构中第22位氨基酸残基系列突变对K_m与K_(cat)的影响 | 第126-127页 |
| 5.2.5 活性架构中第22位氨基酸残基系列突变对降解产物的影响 | 第127-128页 |
| 5.2.6 活性架构中第22位氨基酸残基系列突变对酶分子与CMC结合能力的影响 | 第128-131页 |
| 5.2.7 活性架构中第22位氨基酸残基与葡萄糖结合能的理论计算 | 第131-134页 |
| 5.3 讨论 | 第134-138页 |
| 5.3.1 活性架构中多功能性决定氨基酸残基的突变导致功能的快速转变 | 第134-136页 |
| 5.3.2 GH12家族酶分子识别不同底物的结构基础 | 第136-138页 |
| 小结 | 第138-139页 |
| 第6章 GH12家族酶分子在微纤丝上的结合位点及其新功能 | 第139-158页 |
| 6.1 材料和方法 | 第139-143页 |
| 6.1.1 主要试剂 | 第139-140页 |
| 6.1.2 主要仪器 | 第140页 |
| 6.1.3 主要软件及版本 | 第140页 |
| 6.1.4 EGⅢ对纤维素CF11的酶解 | 第140-141页 |
| 6.1.5 CF11酶解过程中还原糖生成量及其反应速度的测定 | 第141页 |
| 6.1.6 酶解前后纤维素CF11结晶度的测定 | 第141页 |
| 6.1.7 扫描电子显微镜(SEM)对纤维素CF11的表面形貌观察 | 第141页 |
| 6.1.8 原子力显微镜(AFM)对纤维素CF11的表面形貌观察 | 第141-142页 |
| 6.1.9 原子力显微镜(AFM)结合切片技术对纤维素CF11的内部形貌观察 | 第142-143页 |
| 6.1.10 超微结构数字图像的定量分析 | 第143页 |
| 6.2 结果与分析 | 第143-154页 |
| 6.2.1 CF11酶解过程中还原糖生成量及其反应速度的测定 | 第143-144页 |
| 6.2.2 酶解过程纤维素结晶度的变化 | 第144-145页 |
| 6.2.3 扫描电子显微镜(SEM)对CF11的表面形貌观察 | 第145-146页 |
| 6.2.4 原子力显微镜(AFM)对CF11酶解前后的表面超微机构观察 | 第146-150页 |
| 6.2.5 原子力显微镜(AFM)对CF11酶解前后的切面超微结果观察 | 第150-154页 |
| 6.3 讨论 | 第154-156页 |
| 小结 | 第156-158页 |
| 全文总结与展望 | 第158-160页 |
| 参考文献 | 第160-170页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第170-172页 |
| 致谢 | 第172-174页 |
| 附录 | 第174-182页 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 | 第182页 |
