论文目录 | |
| 摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-15页 |
| 符号说明 | 第15-19页 |
| 第一章 文献综述 | 第19-55页 |
| 1.1 细菌中Ⅱ型PKS编码多样性芳香化合物的机制 | 第19-40页 |
| 1.1.1 细菌中Ⅱ型PKS编码的化合物简介 | 第19-20页 |
| 1.1.2 芳香化合物的合成需要聚酮合酶基因簇中多个酶发挥作用 | 第20-23页 |
| 1.1.3 Ⅱ型聚酮起始单元加载机制和聚酮链的延伸 | 第23-26页 |
| 1.1.4 酮基还原酶在产生芳香化合物多样性生物合成中的作用 | 第26-31页 |
| 1.1.5 环化酶催化的聚酮化合物不同类型成环方式 | 第31-35页 |
| 1.1.6 氧化酶催化的多种后修饰 | 第35-40页 |
| 1.2 细菌来源的芳香化合物碳骨架重排的研究进展 | 第40-53页 |
| 1.2.1 Fredericamycin A重排研究 | 第42-43页 |
| 1.2.2 Griseorhodin A重排研究 | 第43-46页 |
| 1.2.3 Chartreusin重排研究 | 第46-47页 |
| 1.2.4 PD116198和BE-7585A重排研究 | 第47-49页 |
| 1.2.5 Gilvocarcin重排研究 | 第49-51页 |
| 1.2.6 Jadomycin重排研究 | 第51页 |
| 1.2.7 Kinamycin重排研究 | 第51-53页 |
| 1.2.8 Murayaquinone重排研究 | 第53页 |
| 1.3 本课题的研究内容和意义 | 第53-55页 |
| 第二章 实验材料与方法 | 第55-85页 |
| 2.1 实验材料 | 第55-67页 |
| 2.1.1 菌株 | 第55-56页 |
| 2.1.2 质粒 | 第56-61页 |
| 2.1.3 引物 | 第61页 |
| 2.1.4 培养基 | 第61-63页 |
| 2.1.5 试剂和缓冲液 | 第63-66页 |
| 2.1.6 抗生素 | 第66-67页 |
| 2.2 实验方法 | 第67-85页 |
| 2.2.1 菌种保藏 | 第67页 |
| 2.2.2 大肠杆菌中质粒DNA的小量提取 | 第67页 |
| 2.2.3 大肠杆菌中质粒DNA的快速检测 | 第67-68页 |
| 2.2.4 链霉菌总DNA的少量快速提取 | 第68页 |
| 2.2.5 大肠杆菌DH10B化学感受态的制备 | 第68页 |
| 2.2.6 大肠杆菌DH10B高效电转感受态的制备 | 第68-69页 |
| 2.2.7 质粒DNA或酶连产物对大肠杆菌化学感受态细胞的转化 | 第69页 |
| 2.2.8 质粒DNA或酶连产物对大肠杆菌电转感受态细胞的转化 | 第69页 |
| 2.2.9 质粒或者酶连产物脱盐 | 第69页 |
| 2.2.10 大肠杆菌与链霉菌属间两亲本接合转移 | 第69-70页 |
| 2.2.11 PCR-Targeting方法敲除目标基因 | 第70-72页 |
| 2.2.12 重组蛋白的构建和表达 | 第72-73页 |
| 2.2.13 重组蛋白的纯化与浓缩 | 第73-74页 |
| 2.2.14 SDS-PAGE电泳 | 第74-76页 |
| 2.2.15 蛋白浓度的测定 | 第76页 |
| 2.2.16 化合物分离过程中几种开放柱的使用 | 第76-77页 |
| 2.2.17 三亲本接合转移 | 第77-78页 |
| 2.2.18 三亲本高通量接合转移 | 第78页 |
| 2.2.19 高通量发酵和生物活性测定 | 第78-79页 |
| 2.2.20 阳性接合转移子的复证 | 第79页 |
| 2.2.21 BAC质粒的提取 | 第79-80页 |
| 2.2.22 HPLC检测样品的制备、程序等 | 第80页 |
| 2.2.23 相关化合物的分离纯化 | 第80-83页 |
| 2.2.24 回补质粒的构建 | 第83页 |
| 2.2.25 回补菌株的构建以及发酵检测 | 第83-84页 |
| 2.2.26 生物信息学分析 | 第84-85页 |
| 第三章 村山醌基因簇的发现及直链中间体的确定 | 第85-118页 |
| 3.1 前言 | 第85页 |
| 3.2 村山醌生物合成基因簇的定位 | 第85-93页 |
| 3.2.1 Sgr29 BAC文库高通量异源表达和生物活性筛选 | 第85-86页 |
| 3.2.2 抗菌活性克隆子发酵产物的检测 | 第86-88页 |
| 3.2.3 化合物1-3的结构鉴定 | 第88-90页 |
| 3.2.4 村山醌生物合成基因簇的定位 | 第90-93页 |
| 3.3 村山醌生物合成基因簇边界的确定 | 第93-109页 |
| 3.3.1 基因簇右边界的确定 | 第93-97页 |
| 3.3.2 基因簇调控区域的发现 | 第97-103页 |
| 3.3.3 基因簇左边界的确定 | 第103-104页 |
| 3.3.4 结构基因部分和调控基因部分的再次确认 | 第104-109页 |
| 3.4 村山醌碳骨架重排直链中间体的确定 | 第109-117页 |
| 3.4.1 生物合成基因单基因敲除突变株代谢谱检测及分析 | 第109-113页 |
| 3.4.2 化合物4-6结构鉴定 | 第113-114页 |
| 3.4.3 体内喂养确定碳骨架重排中间体 | 第114-115页 |
| 3.4.4 碳骨架重排中间体6发现的意义 | 第115-117页 |
| 3.5 本章小结 | 第117-118页 |
| 第四章 村山醌生物合成途径中碳骨架重排机理研究 | 第118-138页 |
| 4.1 前言 | 第118页 |
| 4.2 参与中间体6到终产物1重排转化的酶的确定 | 第118-120页 |
| 4.3 蛋白MrqO3、MrqO6和MrqO7能够将化合物6转化为村山醌 | 第120-126页 |
| 4.3.1 蛋白MrqO3、MrqO6和MrqO7的表达及纯化 | 第120-123页 |
| 4.3.2蛋白MrqO7、MrqO6和MrqO3体外将底物6转化为村山醌1 | 第123-126页 |
| 4.4 酶促反应顺序的探讨 | 第126-131页 |
| 4.5 底物6经MrqO7催化后底物的确定 | 第131-133页 |
| 4.6 底物6经MrqO7和MrqO6催化后产物的探索 | 第133-134页 |
| 4.7 MrqO3催化机理的探索 | 第134-135页 |
| 4.8 中间体6到终产物1转化过程中碳骨架重排机理的推测 | 第135-137页 |
| 4.9 本章小结 | 第137-138页 |
| 第五章 村山醌生物合成途径的推测 | 第138-144页 |
| 5.1 前言 | 第138页 |
| 5.2 聚酮链的延伸和折叠 | 第138-140页 |
| 5.3 芳香化合物中间体的后修饰 | 第140-141页 |
| 5.4 村山醌到村山内酯转化的研究 | 第141-143页 |
| 5.5 本章小结 | 第143-144页 |
| 第六章 总结与展望 | 第144-147页 |
| 6.1 本研究工作总结 | 第144-145页 |
| 6.2 本研究主要创新点 | 第145页 |
| 6.3 本研究工作展望 | 第145-147页 |
| 参考文献 | 第147-157页 |
| 附录 | 第157-196页 |
| 附录一 本研究中用到的引物 | 第157-172页 |
| 附录二 PCR验证突变质粒得到的预期条带大小及胶图 | 第172-178页 |
| 附录三 化合物1~a、2~b、3~b的核磁数据(溶剂为氘代氯仿) | 第178-179页 |
| 附录四 化合物4~a、5~b、6~c的核磁数据(溶剂为氘代氯仿) | 第179-180页 |
| 附录五 NMR图谱 | 第180-193页 |
| 附录六 MrqM和MrqG相关分析 | 第193-196页 |
| 致谢 | 第196-198页 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 | 第198-200页 |
