论文目录 | |
| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-12页 |
| 前言 | 第12-14页 |
| 第一章 文献综述 | 第14-36页 |
| 1.1 蛋白质的糖基化 | 第14-20页 |
| 1.1.1 糖基化 | 第14页 |
| 1.1.2 糖基化的结构与类型 | 第14-16页 |
| 1.1.3 糖基化的形成途径 | 第16-19页 |
| 1.1.4 影响糖基化的因素 | 第19-20页 |
| 1.2 蛋白质糖基化的作用 | 第20-24页 |
| 1.2.1 对新生肽折叠的影响 | 第20-21页 |
| 1.2.2 对蛋白质构象的影响 | 第21-22页 |
| 1.2.3 对蛋白质分泌的影响 | 第22页 |
| 1.2.4 对蛋白功能的影响 | 第22-23页 |
| 1.2.5 对蛋白质稳定性的影响 | 第23-24页 |
| 1.3 蛋白质糖基化的研究方法与技术 | 第24-29页 |
| 1.3.1 糖蛋白的鉴定方法 | 第24-25页 |
| 1.3.2 糖蛋白的分离纯化技术 | 第25-26页 |
| 1.3.3 糖基化位点的鉴定 | 第26-28页 |
| 1.3.4 糖链大小及结构分析 | 第28页 |
| 1.3.5 糖形及糖蛋白空间结构分析 | 第28-29页 |
| 1.4 蛋白质糖基化工程 | 第29-32页 |
| 1.4.1 蛋白质糖基化工程 | 第30页 |
| 1.4.2 蛋白质糖基化工程的研究方法 | 第30-31页 |
| 1.4.3 蛋白质糖基化工程的发展趋势 | 第31-32页 |
| 1.5 β-葡萄糖醛酸苷酶 | 第32-35页 |
| 1.5.1 β-葡萄糖醛酸苷酶的概述 | 第32-34页 |
| 1.5.2 β-葡萄糖醛酸苷酶糖基化研究现状 | 第34-35页 |
| 1.6 论文选题依据及研究内容 | 第35-36页 |
| 1.6.1 选题依据 | 第35页 |
| 1.6.2 研究内容 | 第35-36页 |
| 第二章 β-葡萄糖醛酸苷酶的潜在N-糖基化分析与验证 | 第36-56页 |
| 引言 | 第36-37页 |
| 2.1 材料 | 第37-41页 |
| 2.1.1 菌株与质粒 | 第37页 |
| 2.1.2 药品与试剂 | 第37-38页 |
| 2.1.3 仪器设备 | 第38-39页 |
| 2.1.4 主要溶液 | 第39-41页 |
| 2.2 方法 | 第41-47页 |
| 2.2.1 毕赤酵母和大肠杆菌的培养 | 第41页 |
| 2.2.2 快速定点突变 | 第41-43页 |
| 2.2.3 毕赤酵母的基因操作 | 第43页 |
| 2.2.4 外源蛋白在毕赤酵母中的表达 | 第43-44页 |
| 2.2.5 毕赤酵母表达蛋白的纯化 | 第44页 |
| 2.2.6 β-葡萄糖醛酸苷酶活力及蛋白质浓度的测定 | 第44-46页 |
| 2.2.7 糖苷酶酶切及蛋白SDS-PAGE分析 | 第46页 |
| 2.2.8 突变酶热稳定性的分析 | 第46-47页 |
| 2.2.9 三维结构分析 | 第47页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第47-55页 |
| 2.3.1 潜在糖基化位点分析 | 第47-49页 |
| 2.3.2 潜在糖基化单点突变及验证 | 第49-50页 |
| 2.3.3 潜在糖基化双点突变及验证 | 第50-51页 |
| 2.3.4 潜在糖基化三点突变及验证 | 第51页 |
| 2.3.5 潜在糖基化突变酶活性及稳定性分析 | 第51-55页 |
| 2.4 小结 | 第55-56页 |
| 第三章 β-葡萄糖醛酸苷酶糖基化位点的半理性设计与构建 | 第56-80页 |
| 引言 | 第56页 |
| 3.1 材料 | 第56-59页 |
| 3.1.1 菌株与质粒 | 第56-57页 |
| 3.1.2 药品与试剂 | 第57页 |
| 3.1.3 仪器设备 | 第57-58页 |
| 3.1.4 主要溶液 | 第58-59页 |
| 3.2 方法 | 第59-64页 |
| 3.2.1 结构模拟分析 | 第59页 |
| 3.2.2 毕赤酵母和大肠杆菌的培养 | 第59页 |
| 3.2.3 快速定点突变 | 第59-62页 |
| 3.2.4 蓝白斑快速筛选阳性突变 | 第62页 |
| 3.2.5 高甘露糖糖蛋白的快速筛选 | 第62-63页 |
| 3.2.6 毕赤酵母表达蛋白的制备 | 第63页 |
| 3.2.7 最适催化反应pH | 第63页 |
| 3.2.8 最适催化反应温度 | 第63页 |
| 3.2.9 金属离子对酶的影响 | 第63-64页 |
| 3.2.10 反应动力学常数的测定 | 第64页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第64-78页 |
| 3.3.1 糖基化位点的半理性设计 | 第64-69页 |
| 3.3.2 糖基化突变酶库的建立与快速筛选 | 第69-71页 |
| 3.3.3 糖基化突变酶的表达与验证 | 第71-72页 |
| 3.3.4 糖基化位点与糖基化效率分析 | 第72-74页 |
| 3.3.5 糖基化突变酶的酶活分析 | 第74-75页 |
| 3.3.6 糖基化对酶最适反应pH和温度的影响 | 第75-76页 |
| 3.3.7 糖基化对金属离子与酶相互作用关系的影响 | 第76-77页 |
| 3.3.8 糖基化突变酶反应动力学常数分析 | 第77-78页 |
| 3.4 小结 | 第78-80页 |
| 第四章 糖基化突变酶抗逆性能的筛选与分析 | 第80-91页 |
| 引言 | 第80页 |
| 4.1 材料 | 第80-81页 |
| 4.1.1 菌株 | 第80页 |
| 4.1.2 药品与试剂 | 第80-81页 |
| 4.1.3 仪器设备 | 第81页 |
| 4.1.4 主要溶液 | 第81页 |
| 4.2 方法 | 第81-82页 |
| 4.2.1 热稳定性分析 | 第81页 |
| 4.2.2 酸碱稳定性分析 | 第81-82页 |
| 4.2.3 变性剂稳定性分析 | 第82页 |
| 4.2.4 有机溶剂稳定性分析 | 第82页 |
| 4.2.5 甘草酸的水解反应分析 | 第82页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第82-90页 |
| 4.3.1 热稳定性筛选与分析 | 第82-85页 |
| 4.3.2 酸碱稳定性筛选与分析 | 第85-86页 |
| 4.3.3 变性剂稳定性筛选与分析 | 第86-87页 |
| 4.3.4 有机溶剂稳定性筛选与分析 | 第87-89页 |
| 4.3.5 糖基化突变酶催化甘草酸的水解反应 | 第89-90页 |
| 4.4 小结 | 第90-91页 |
| 第五章 糖基化调节β-葡萄糖醛酸苷酶的热稳定性 | 第91-112页 |
| 引言 | 第91-92页 |
| 5.1 材料 | 第92-93页 |
| 5.1.1 菌株与质粒 | 第92页 |
| 5.1.2 药品与试剂 | 第92页 |
| 5.1.3 仪器设备 | 第92-93页 |
| 5.1.4 主要溶液 | 第93页 |
| 5.2 方法 | 第93-96页 |
| 5.2.1 原核表达体系构建 | 第93-94页 |
| 5.2.2 无糖基化酶的制备 | 第94-95页 |
| 5.2.3 差示扫描量热检测 | 第95页 |
| 5.2.4 荧光光谱检测 | 第95页 |
| 5.2.5 圆二色谱检测 | 第95页 |
| 5.2.6 构象稳定性检测 | 第95页 |
| 5.2.7 分子动力学模拟分析 | 第95-96页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第96-111页 |
| 5.3.1 糖基化对酶热稳定性影响的验证 | 第96-99页 |
| 5.3.2 热学特性分析 | 第99-100页 |
| 5.3.3 荧光光谱三级结构分析 | 第100-101页 |
| 5.3.4 圆二色谱二级结构分析 | 第101-103页 |
| 5.3.5 构象稳定性分析 | 第103-104页 |
| 5.3.6 分子动力学模拟糖链与蛋白结合构象 | 第104-110页 |
| 5.3.7 分子动力学分析糖链与蛋白结合能量 | 第110-111页 |
| 5.4 小结 | 第111-112页 |
| 第六章 多位点糖基化对β-葡萄糖醛酸苷酶催化特性的影响 | 第112-123页 |
| 引言 | 第112页 |
| 6.1 材料 | 第112-113页 |
| 6.1.1 菌株与质粒 | 第112-113页 |
| 6.1.2 药品与试剂 | 第113页 |
| 6.1.3 仪器设备 | 第113页 |
| 6.1.4 主要溶液 | 第113页 |
| 6.2 方法 | 第113-115页 |
| 6.2.1 快速定点突变 | 第113页 |
| 6.2.2 催化甘草酸的比酶活测定 | 第113-114页 |
| 6.2.3 热稳定性测定 | 第114页 |
| 6.2.4 催化甘草酸的反应动力学常数测定 | 第114-115页 |
| 6.2.5 多糖基化特异性突变酶催化甘草酸的水解反应进程 | 第115页 |
| 6.3 结果与讨论 | 第115-122页 |
| 6.3.1 多位点糖基化突变酶的构建与表达 | 第115-116页 |
| 6.3.2 多位点糖基化突变酶热稳定性的分析 | 第116-118页 |
| 6.3.3 多位点糖基化特异性突变酶的构建与表达 | 第118页 |
| 6.3.4 多位点糖基化特异性突变酶热稳定性的分析 | 第118-119页 |
| 6.3.5 多位点糖基化特异性突变酶酶活分析 | 第119-120页 |
| 6.3.6 多位点糖基化特异性突变酶反应动力学常数 | 第120页 |
| 6.3.7 多位点糖基化特异性突变酶催化甘草酸的水解反应进程 | 第120-122页 |
| 6.4 小结 | 第122-123页 |
| 第七章 结论与展望 | 第123-127页 |
| 7.1 结论 | 第123-125页 |
| 7.2 创新点 | 第125页 |
| 7.3 展望 | 第125-127页 |
| 参考文献 | 第127-138页 |
| 发表文章及参加科研情况说明 | 第138-139页 |
| 致谢 | 第139-140页 |
