论文目录 | |
| 摘要 | 第1-17页 |
| Abstract | 第17-19页 |
| 第一章 前言 | 第20-45页 |
| 1 植物抗寒分子生物学研究进展 | 第20-37页 |
| 1.1 植物抗寒相关基因 | 第20-27页 |
| 1.1.1 抗冻蛋白基因 | 第21-22页 |
| 1.1.2 冷诱导基因 | 第22-23页 |
| 1.1.3 脂肪酸去饱和酶基因 | 第23-24页 |
| 1.1.4 抗氧化酶活性基因 | 第24-25页 |
| 1.1.5 渗透调节相关酶基因 | 第25-26页 |
| 1.1.6 低温信号转录因子 | 第26-27页 |
| 1.2 植物基因克隆方法研究进展 | 第27-37页 |
| 1.2.1 功能克隆 | 第27-28页 |
| 1.2.2 图位克隆 | 第28-29页 |
| 1.2.3 转座子标签法 | 第29页 |
| 1.2.4 差异显示法 | 第29-32页 |
| 1.2.4.1 DDRT-PCR | 第30-31页 |
| 1.2.4.2 RDA | 第31页 |
| 1.2.4.3 SSH | 第31-32页 |
| 1.2.5 RACE法 | 第32-33页 |
| 1.2.6 基因芯片技术 | 第33-35页 |
| 1.2.7 电子克隆 | 第35-37页 |
| 2 红掌研究进展 | 第37-43页 |
| 2.1 组织培养 | 第37-38页 |
| 2.2 遗传育种 | 第38-41页 |
| 2.2.1 种质资源搜集与创新 | 第39页 |
| 2.2.2 杂交育种 | 第39页 |
| 2.2.3 诱变育种 | 第39-40页 |
| 2.2.4 倍性育种 | 第40页 |
| 2.2.5 基因工程育种 | 第40-41页 |
| 2.3 抗性生理 | 第41-43页 |
| 3 本研究的主要内容和技术路线 | 第43-45页 |
| 3.1 研究内容 | 第43-44页 |
| 3.2 技术路线 | 第44-45页 |
| 第二章 红掌AOX、CAT和APX基因的克隆与表达分析 | 第45-90页 |
| 1 交替氧化酶基因克隆与表达分析 | 第45-65页 |
| 1.1 材料与方法 | 第46-56页 |
| 1.1.1 试验材料 | 第46页 |
| 1.1.1.1 植物材料 | 第46页 |
| 1.1.1.2 菌株与质粒 | 第46页 |
| 1.1.1.3 各种酶类 | 第46页 |
| 1.1.1.4 试剂盒 | 第46页 |
| 1.1.1.5 常用储备液 | 第46页 |
| 1.1.2 方法 | 第46-56页 |
| 1.1.2.1 总RNA的提取 | 第46-47页 |
| 1.1.2.2 sscDNA的合成 | 第47-48页 |
| 1.1.2.3 引物设计 | 第48页 |
| 1.1.2.4 PCR扩增 | 第48-49页 |
| 1.1.2.5 3'RACE | 第49-50页 |
| 1.1.2.6 5'RACE | 第50-53页 |
| 1.1.2.7 目的片段的回收及克隆 | 第53-54页 |
| 1.1.2.8 红掌AOX全长序列的获得 | 第54-55页 |
| 1.1.2.9 基因序列分析及同源性分析 | 第55页 |
| 1.1.2.10 实时荧光定量PCR分析 | 第55-56页 |
| 1.2 结果与分析 | 第56-64页 |
| 1.2.1 总RNA的提取和检测 | 第56页 |
| 1.2.2 红掌AOX基因的克隆与分析 | 第56-58页 |
| 1.2.2.1 红掌AOX基因cDNA中间片段的扩增 | 第56-57页 |
| 1.2.2.2 3'RACE | 第57页 |
| 1.2.2.3 5'RACE | 第57页 |
| 1.2.2.4 红掌AOX基因cDNA全长的拼接 | 第57-58页 |
| 1.2.3 AnAOX基因的序列分析与同源性比较 | 第58-62页 |
| 1.2.3.1 序列分析 | 第58-59页 |
| 1.2.3.2 同源性比较 | 第59-62页 |
| 1.2.4 红掌AOX基因的组织表达特性分析 | 第62页 |
| 1.2.5 低温胁迫对红掌幼叶叶绿素荧光参数的影响 | 第62-63页 |
| 1.2.6 红掌AOX基因在低温胁迫下的表达分析 | 第63-64页 |
| 1.3 结论与讨论 | 第64-65页 |
| 2 过氧化氢酶基因克隆与表达分析 | 第65-78页 |
| 2.1 材料与方法 | 第65-70页 |
| 2.1.1 试验材料与试剂 | 第65-66页 |
| 2.1.2 方法 | 第66-70页 |
| 2.1.2.1 总RNA的提取 | 第66页 |
| 2.1.2.2 sscDNA的合成 | 第66页 |
| 2.1.2.3 引物的设计 | 第66页 |
| 2.1.2.4 PCR扩增 | 第66页 |
| 2.1.2.5 3'RACE | 第66-67页 |
| 2.1.2.6 5'RACE | 第67-68页 |
| 2.1.2.7 目的片段的回收及克隆 | 第68-69页 |
| 2.1.2.8 红掌CAT全长序列的获得 | 第69页 |
| 2.1.2.9 基因序列分析及同源性分析 | 第69页 |
| 2.1.2.10 实时荧光定量PCR分析 | 第69-70页 |
| 2.2 结果与分析 | 第70-77页 |
| 2.2.1 总RNA的提取和检测 | 第70页 |
| 2.2.2 红掌CAT基因的克隆与分析 | 第70-73页 |
| 2.2.2.1 红掌CAT基因cDNA中间片段的扩增 | 第70页 |
| 2.2.2.2 3'RACE | 第70页 |
| 2.2.2.3 5'RACE | 第70页 |
| 2.2.2.4 红掌CAT基因cDNA全长的拼接 | 第70-73页 |
| 2.2.3 AnCAT基因的序列分析与同源性比较 | 第73-76页 |
| 2.2.3.1 序列分析 | 第73页 |
| 2.2.3.2 同源性比较 | 第73-76页 |
| 2.2.4 红掌CAT基因的组织表达特性分析 | 第76页 |
| 2.2.5 红掌CAT基因在低温胁迫下的表达分析 | 第76-77页 |
| 2.3 结论与讨论 | 第77-78页 |
| 3 抗坏血酸过氧化物酶基因克隆与表达分析 | 第78-90页 |
| 3.1 材料与方法 | 第79-81页 |
| 3.1.1 试验材料与试剂 | 第79页 |
| 3.1.2 方法 | 第79-81页 |
| 3.1.2.1 总RNA的提取 | 第79页 |
| 3.1.2.2 sscDNA的合成 | 第79页 |
| 3.1.2.3 引物的设计 | 第79-80页 |
| 3.1.2.4 PCR扩增 | 第80页 |
| 3.1.2.5 3'RACE | 第80页 |
| 3.1.2.6 5'RACE | 第80页 |
| 3.1.2.7 目的片段的回收及克隆 | 第80页 |
| 3.1.2.8 红掌APX全长序列的获得 | 第80-81页 |
| 3.1.2.9 基因序列分析及同源性分析 | 第81页 |
| 3.1.2.10 实时荧光定量PCR分析 | 第81页 |
| 3.2 结果与分析 | 第81-89页 |
| 3.2.1 总RNA的提取和检测 | 第81-82页 |
| 3.2.2 红掌APX基因的克隆与分析 | 第82-84页 |
| 3.2.2.1 红掌APX基因cDNA中间片段的扩增 | 第82页 |
| 3.2.2.2 3'RACE | 第82页 |
| 3.2.2.3 5'RACE | 第82页 |
| 3.2.2.4 红掌APX基因cDNA全长的拼接 | 第82-84页 |
| 3.2.3 AnAPX基因的序列分析与同源性比较 | 第84-87页 |
| 3.2.3.1 序列分析 | 第84-85页 |
| 3.2.3.2 同源性比较 | 第85-87页 |
| 3.2.4 红掌APX基因组织表达特性分析 | 第87-88页 |
| 3.2.5 红掌APX基因在低温胁迫下的表达分析 | 第88-89页 |
| 3.3 结论与讨论 | 第89-90页 |
| 第三章 红掌ANAPX基因植物表达载体的构建 | 第90-100页 |
| 1 实验材料 | 第90-91页 |
| 1.1 菌株和质粒 | 第90页 |
| 1.2 酶及分子生物学试剂 | 第90页 |
| 1.3 各种实验试剂的配制 | 第90-91页 |
| 1.3.1 主要试剂的配制 | 第90页 |
| 1.3.2 主要培养基的配制 | 第90-91页 |
| 1.4 实验所需引物序列 | 第91页 |
| 2 实验方法 | 第91-96页 |
| 2.1 目的基因插入片段的获得 | 第91-93页 |
| 2.1.1 摇菌 | 第91页 |
| 2.1.2 质粒DNA的提取 | 第91-92页 |
| 2.1.3 目的片段的双酶切 | 第92页 |
| 2.1.4 目的片段的回收 | 第92-93页 |
| 2.2 线性载体的获得 | 第93页 |
| 2.2.1 质粒载体pCAMBIA2300的双酶切 | 第93页 |
| 2.2.2 线性载体的回收 | 第93页 |
| 2.3 目的基因与线性载体的连接 | 第93页 |
| 2.4 连接产物转化大肠杆菌感受态细胞 | 第93-94页 |
| 2.5 重组质粒的筛选与鉴定 | 第94-95页 |
| 2.5.1 重组质粒的DNA提取 | 第94页 |
| 2.5.2 重组质粒的酶切鉴定 | 第94-95页 |
| 2.5.3 重组质粒的测序验证 | 第95页 |
| 2.6 植物表达载体导入根癌农杆菌EHA105及其鉴定 | 第95-96页 |
| 2.6.1 农杆菌感受态细胞的制备 | 第95页 |
| 2.6.2 农杆菌感受态的电转化 | 第95页 |
| 2.6.3 转化菌的鉴定 | 第95-96页 |
| 3 结果与分析 | 第96-99页 |
| 3.1 红掌APX基因植物表达载体的构建 | 第96页 |
| 3.2 重组质粒的转化农杆菌 | 第96-99页 |
| 4 结论与讨论 | 第99-100页 |
| 第四章 红掌抗坏血酸过氧化物酶基因ANAPX转化烟草 | 第100-115页 |
| 1 实验材料 | 第100-101页 |
| 1.1 菌种和转化的植物材料 | 第100页 |
| 1.2 化学试剂配制 | 第100页 |
| 1.3 培养基配制 | 第100-101页 |
| 2 实验方法 | 第101-106页 |
| 2.1 烟草的组织培养 | 第101页 |
| 2.2 根癌农杆菌介导法转化烟草 | 第101页 |
| 2.3 转基因植株的鉴定 | 第101-104页 |
| 2.3.1 烟草基因组DNA的提取及定量分析 | 第101-102页 |
| 2.3.2 烟草总RNA的提取及定量分析 | 第102-103页 |
| 2.3.3 烟草总RNA反转录合成cDNA | 第103-104页 |
| 2.3.4 烟草基因组DNA的PCR检测 | 第104页 |
| 2.3.5 转基因烟草阳性植株的RT-PCR检测 | 第104页 |
| 2.4 转基因烟草阳性植株的抗寒性分析 | 第104-106页 |
| 2.4.1 相对电导率测定 | 第105页 |
| 2.4.2 丙二醛含量测定 | 第105页 |
| 2.4.3 抗氧化酶活性测定 | 第105-106页 |
| 3 结果与分析 | 第106-113页 |
| 3.1 烟草组培苗的获得 | 第106-107页 |
| 3.2 转基因烟草植株的获得 | 第107-108页 |
| 3.3 转基因植株的鉴定 | 第108-110页 |
| 3.3.1 T0代转基因植株的PCR鉴定 | 第108-109页 |
| 3.3.2 T0代转基因烟草植株的实时定量PCR | 第109-110页 |
| 3.4 T0代转基因烟草抗寒性分析 | 第110-113页 |
| 3.4.1 相对电导率 | 第110-111页 |
| 3.4.2 MDA含量 | 第111页 |
| 3.4.3 抗氧化酶活性 | 第111-113页 |
| 4 结论与讨论 | 第113-115页 |
| 第五章 红掌基因转化研究 | 第115-129页 |
| 1 材料 | 第115-116页 |
| 2 实验方法 | 第116-119页 |
| 2.1 不同外植体类型对愈伤诱导的影响 | 第116页 |
| 2.2 不同激素类型对愈伤诱导的影响 | 第116页 |
| 2.3 不同激素浓度对芽分化/增殖的影响 | 第116页 |
| 2.4 愈伤组织和芽的抗生素浓度筛选 | 第116-117页 |
| 2.4.1 卡那霉素浓度对红掌愈伤组织分化和芽生长的影响 | 第116页 |
| 2.4.2 G_(418)浓度对红掌愈伤组织分化和芽生长的影响 | 第116-117页 |
| 2.4.3 头孢霉素浓度对红掌愈伤组织分化和芽生长的影响 | 第117页 |
| 2.5 农杆菌菌液的制备 | 第117页 |
| 2.6 农杆菌菌株类型和菌液侵染时间对红掌愈伤组织转化的影响 | 第117页 |
| 2.7 目的基因转化红掌 | 第117-118页 |
| 2.7.1 GFP基因转化红掌 | 第117-118页 |
| 2.7.2 FAD_3基因转化红掌 | 第118页 |
| 2.8 转基因试管苗生根和移栽 | 第118页 |
| 2.9 转基因植株的鉴定 | 第118-119页 |
| 2.9.1 红掌基因组DNA提取 | 第118-119页 |
| 2.9.2 基因组DNA的PCR检测 | 第119页 |
| 3 结果与分析 | 第119-127页 |
| 3.1 激素类型对愈伤诱导的影响 | 第119-120页 |
| 3.2 外植体类型对愈伤诱导的影响 | 第120页 |
| 3.3 6-BA浓度对红掌芽增殖的影响 | 第120-122页 |
| 3.4 抗生素浓度对愈伤组织/芽生长的影响 | 第122-124页 |
| 3.4.1 卡那霉素浓度对红掌愈伤组织分化和芽生长的影响 | 第122页 |
| 3.4.2 G_(418)浓度对红掌愈伤组织分化和芽生长的影响 | 第122页 |
| 3.4.3 头孢霉素浓度对红掌愈伤组织分化和芽生长的影响 | 第122-124页 |
| 3.5 农杆菌菌株类型和菌液侵染时间对红掌愈伤组织转化的影响 | 第124-125页 |
| 3.6 转基因植株的获得 | 第125-127页 |
| 3.6.1 GFP转基因植株的获得 | 第125-126页 |
| 3.6.2 FAD_3转基因植株的获得 | 第126-127页 |
| 3.6.3 转基因苗的PCR鉴定 | 第127页 |
| 4 结论与讨论 | 第127-129页 |
| 参考文献 | 第129-153页 |
| 致谢 | 第153页 |
