论文目录 | |
| 摘要 | 第1-7页 |
| Abstract | 第7-16页 |
| 主要符号表 | 第16-17页 |
| 第一章 绪论 | 第17-32页 |
| 1.1 蜡酯的概述 | 第17-18页 |
| 1.1.1 蜡酯的概念 | 第17页 |
| 1.1.2 蜡酯的功能以及其应用 | 第17-18页 |
| 1.2 蜡酯的合成途径 | 第18-25页 |
| 1.2.1 植物中蜡酯的合成途径 | 第19-20页 |
| 1.2.2 动物以及昆虫中的蜡酯合成 | 第20-21页 |
| 1.2.3 微生物中的蜡酯合成途径 | 第21-25页 |
| 1.3 利用微生物，藻类合成以及提高蜡酯产量的基因工程策略 | 第25-27页 |
| 1.4 破囊壶菌概述 | 第27-28页 |
| 1.5 酿酒酵母合成油脂代谢路径的概述 | 第28-29页 |
| 1.6 本研究内容及意义，创新点 | 第29-32页 |
| 1.6.1 研究意义与内容 | 第29-30页 |
| 1.6.2 本文创新点 | 第30-32页 |
| 第二章 破囊壶菌中WS/DGAT酶TrWSD4和TrWSD5的生物信息学分析及编码序列扩增 | 第32-40页 |
| 2.1 实验材料 | 第32-33页 |
| 2.1.1 菌株 | 第32页 |
| 2.1.2 酶，试剂盒以及化学药品 | 第32-33页 |
| 2.1.3 培养基与溶液 | 第33页 |
| 2.1.4 仪器设备 | 第33页 |
| 2.2 方法与步骤 | 第33-35页 |
| 2.2.1 破囊壶菌中RNA的提取 | 第33-34页 |
| 2.2.2 利用RT-PCR得到cDNA模板 | 第34页 |
| 2.2.3 对TrWSD4，TrWSD5序列做生物信息学分析 | 第34-35页 |
| 2.3 结果与分析 | 第35-38页 |
| 2.3.1 对TrWSD4，TrWSD5蛋白质序列在NCBI中做Blastp以及CD分析 | 第35页 |
| 2.3.2 对不同来源的DGAT以及WS/DGAT蛋白家族做进化树分析 | 第35-36页 |
| 2.3.3 对TrWSD4，TrWSD5的蛋白质序列的保守位点分析 | 第36-37页 |
| 2.3.4 对TrWSD4，TrWSD5的蛋白质序列做跨膜结构域的分析 | 第37-38页 |
| 2.4 讨论 | 第38-40页 |
| 第三章 破囊壶菌中蜡酯合成酶以及脂酰辅酶A:酰基转移酶TrWSD4酶学性质研究 | 第40-57页 |
| 3.1 实验材料 | 第41-43页 |
| 3.1.1 菌株以及载体 | 第41页 |
| 3.1.2 酶、试剂盒以及化学药品 | 第41页 |
| 3.1.3 培养基和溶液 | 第41-42页 |
| 3.1.4 仪器设备 | 第42-43页 |
| 3.1.5 引物序列 | 第43页 |
| 3.2 方法和步骤 | 第43-49页 |
| 3.2.1 TrWSD4基因克隆以及表达载体的构建 | 第43-46页 |
| 3.2.2 TrWSD4基因的异源表达 | 第46页 |
| 3.2.3 TrWSD4蛋白的纯化以及酶活力测定 | 第46-49页 |
| 3.3 结果与分析 | 第49-55页 |
| 3.3.1 TrWSD4基因构建表达载体以及转化 | 第49-50页 |
| 3.3.2 TrWSD4蛋白的表达与纯化 | 第50页 |
| 3.3.3 TrWSD4酶活力测定以及底物偏好性分析 | 第50-52页 |
| 3.3.4 TrWSD4酶的酶学性质分析 | 第52-55页 |
| 3.4 讨论 | 第55-57页 |
| 第四章 破囊壶菌中蜡酯合成酶以及脂酰基辅酶A:酰基转移酶TrWSD5酶学性质研究 | 第57-72页 |
| 4.1 实验材料 | 第57-60页 |
| 4.1.1 菌株以及载体 | 第57-58页 |
| 4.1.2 酶、试剂盒以及化学药品 | 第58页 |
| 4.1.3 培养基和溶液 | 第58-59页 |
| 4.1.4 仪器设备 | 第59页 |
| 4.1.5 引物序列 | 第59-60页 |
| 4.2 方法和步骤 | 第60-65页 |
| 4.2.1 TrWSD5基因合成以及表达载体的构建 | 第60-62页 |
| 4.2.2 TrWSD5基因的异源表达 | 第62-63页 |
| 4.2.3 TrWSD5蛋白的纯化以及酶活力测定 | 第63-65页 |
| 4.3 结果与分析 | 第65-70页 |
| 4.3.1 pMBPc::TrWSD5转化大肠杆菌RossettaDE3中菌落PCR检测阳性转化子 | 第65-66页 |
| 4.3.2 TrWSD5蛋白的表达与纯化 | 第66页 |
| 4.3.3 TrWSD5酶活力测定以及底物偏好性分析 | 第66-68页 |
| 4.3.4 TrWSD5酶的酶学性质分析 | 第68-70页 |
| 4.4 讨论 | 第70-72页 |
| 第五章 TrWSD4与TrWSD5在酿酒酵母突变株中的表达以及对脂肪醇偏好性分析 | 第72-84页 |
| 5.1 实验材料 | 第72-74页 |
| 5.1.1 菌株以及相关载体 | 第72页 |
| 5.1.3 酶，试剂盒以及化学药品 | 第72-73页 |
| 5.1.4 培养基 | 第73页 |
| 5.1.5 仪器设备 | 第73-74页 |
| 5.1.6 引物序列 | 第74页 |
| 5.2 方法和步骤 | 第74-79页 |
| 5.2.1 分别对TrWSD4与TrWSD5构建用于酿酒酵母表达的表达载体 | 第74-76页 |
| 5.2.2 将成功构建的质粒电击转化酿酒酵母H1246中 | 第76页 |
| 5.2.3 阳性酵母转化株的检测 | 第76-77页 |
| 5.2.4 阳性酵母转化株的发酵与诱导培养 | 第77页 |
| 5.2.5 对诱导培养后空载体，TrWSD4，TrWSD5做蜡酯产物分析 | 第77页 |
| 5.2.6 对TrWSD4，TrWSD5两个酶做体内脂肪醇底物偏好性分析 | 第77-79页 |
| 5.3 结果与分析 | 第79-82页 |
| 5.3.1 对构建的pESC-Ura::TrWSD4，pESC-Ura::TrWSD5酶切检测 | 第79页 |
| 5.3.2 对TrWSD4，TrWSD5酿酒酵母阳性转化子的检测 | 第79页 |
| 5.3.3 对TrWSD4与TrWSD5在酵母中的功能验证 | 第79-80页 |
| 5.3.4 TrWSD4对不同碳链长度的脂肪醇的进行底物偏好性分析 | 第80-81页 |
| 5.3.5 TrWSD5对不同碳链长度的脂肪醇的进行底物偏好性分析 | 第81-82页 |
| 5.3.6 GC-MS分析酵母转化子产生的蜡酯 | 第82页 |
| 5.4 讨论 | 第82-84页 |
| 第六章 结论 | 第84-86页 |
| 参考文献 | 第86-92页 |
| 附录 | 第92-93页 |
| 致谢 | 第93页 |
