论文目录 | |
| 摘要 | 第1-7页 |
| abstract | 第7-15页 |
| 第1章 绪论 | 第15-29页 |
| 1.1 红霉素及其生产菌 | 第15-16页 |
| 1.1.1 红霉素理化性质及结构 | 第15页 |
| 1.1.2 红霉素的抑菌机制和应用范围 | 第15-16页 |
| 1.1.3 红霉素的主要工业生产菌 | 第16页 |
| 1.2 红霉素A的生物合成途径 | 第16-18页 |
| 1.2.1 前体的合成 | 第16-17页 |
| 1.2.2 红霉素A的生物合成 | 第17-18页 |
| 1.3 同位素标记实验技术的发展 | 第18-21页 |
| 1.3.1 同位素标记实验技术简介 | 第18-19页 |
| 1.3.2 稳定同位素标记实验的发展 | 第19-20页 |
| 1.3.3 稳定同位素标记技术在当前的主要应用 | 第20-21页 |
| 1.4 微生物代谢物组分析技术研究进展 | 第21-26页 |
| 1.4.1 微生物代谢物组分析简介 | 第21-22页 |
| 1.4.2 代谢物组分析过程中的细胞培养方法 | 第22-23页 |
| 1.4.3 代谢物组分析过程中的快速取样技术 | 第23页 |
| 1.4.4 微生物代谢反应的灭活方法发展 | 第23-24页 |
| 1.4.5 胞内代谢物提取方法 | 第24-25页 |
| 1.4.6 代谢物的测定方法的发展 | 第25-26页 |
| 1.5 红色糖多孢菌基因工程改造 | 第26页 |
| 1.6 高通量筛选技术简介 | 第26-27页 |
| 1.7 本课题的研究内容与意义 | 第27-29页 |
| 第2章 材料与方法 | 第29-35页 |
| 2.1 实验材料 | 第29-30页 |
| 2.1.1 菌株 | 第29页 |
| 2.1.2 培养基 | 第29-30页 |
| 2.1.3 溶液配置 | 第30页 |
| 2.2 实验方法 | 第30-32页 |
| 2.2.1 斜面培养 | 第30页 |
| 2.2.2 摇瓶种子培养 | 第30页 |
| 2.2.3 摇瓶发酵培养 | 第30-31页 |
| 2.2.4 5L发酵罐培养 | 第31-32页 |
| 2.3 实验设备及试剂 | 第32-33页 |
| 2.3.1 发酵设备 | 第32-33页 |
| 2.3.2 其他设备 | 第33页 |
| 2.4 检测方法 | 第33-35页 |
| 2.4.1 菌浓测定 | 第33-34页 |
| 2.4.2 葡萄糖和总糖测定 | 第34页 |
| 2.4.3 豆油浓度测定 | 第34页 |
| 2.4.4 正丙醇浓度 | 第34页 |
| 2.4.5 红霉素测定 | 第34页 |
| 2.4.6 胞外代谢物收集 | 第34-35页 |
| 第3章 S.erythraea代谢物组分析方法的建立 | 第35-49页 |
| 3.1 引言 | 第35-36页 |
| 3.2 材料与方法 | 第36-40页 |
| 3.2.1 菌种 | 第36页 |
| 3.2.2 发酵培养基 | 第36页 |
| 3.2.3 发酵和检测方法 | 第36页 |
| 3.2.4 代谢物浓度测定方法 | 第36-38页 |
| 3.2.5 ~(13)C同位素全标记内标的制备 | 第38-39页 |
| 3.2.6 辅酶A类物质提取 | 第39页 |
| 3.2.7 胞内磷酸糖的提取 | 第39页 |
| 3.2.8 胞内有机酸提取 | 第39-40页 |
| 3.2.9 回收率测定方法 | 第40页 |
| 3.3 胞内代谢物提取方法的优化结果 | 第40-43页 |
| 3.3.1 菌体生长和取样 | 第40-41页 |
| 3.3.2 辅酶A类物质提取方法验证 | 第41页 |
| 3.3.3 磷酸糖提取方法验证 | 第41-42页 |
| 3.3.4 有机酸提取方法验证 | 第42-43页 |
| 3.4 红霉素A合成过程中的代谢物组分析 | 第43-47页 |
| 3.4.1 5L发酵罐中菌体生长和红霉素合成情况 | 第43-44页 |
| 3.4.2 红霉素发酵过程中代谢物组分析 | 第44-46页 |
| 3.4.3 丙酰辅酶浓度与比红霉素合成速率之间的关系 | 第46-47页 |
| 3.5 本章小结 | 第47-49页 |
| 第4章 红色糖多孢菌胞内代谢物~(13)C标记信息分析方法的建立 | 第49-61页 |
| 4.1 引言 | 第49-50页 |
| 4.2 材料与方法 | 第50-53页 |
| 4.2.1 菌种 | 第50页 |
| 4.2.2 培养基 | 第50页 |
| 4.2.3 培养方法 | 第50页 |
| 4.2.4 LC-MS/MS测定有机酸、磷酸糖和辅酶A类物质的基本设置 | 第50页 |
| 4.2.5 GC-MS设置 | 第50页 |
| 4.2.6 菌体蛋白氨基酸同位素信息测定 | 第50-51页 |
| 4.2.7 LC-MS/MS测定同位素信息的方法 | 第51-52页 |
| 4.2.8 胞内有机酸、磷酸糖和辅酶A类物质提取方法 | 第52-53页 |
| 4.2.9 天然标记信息校正 | 第53页 |
| 4.2.10 标准品的理论同位素分布信息计算 | 第53页 |
| 4.2.11 FL(Fractional labeling)计算方法 | 第53页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第53-60页 |
| 4.3.1 GC-MS测定氨基酸同位素信息方法的建立 | 第53-54页 |
| 4.3.2 LC-MS/MS测定有机酸、磷酸糖和辅酶A类物质和的同位素信息方法结果分析 | 第54-58页 |
| 4.3.3 同位素信息分析方法的在红色糖多孢菌中的验证 | 第58-60页 |
| 4.4 本章小结 | 第60-61页 |
| 第5章 S.erythraea葡萄糖与脯氨酸代谢分析 | 第61-78页 |
| 5.1 引言 | 第61-62页 |
| 5.2 材料与方法 | 第62-64页 |
| 5.2.1 菌种 | 第62页 |
| 5.2.2 合成培养基 | 第62页 |
| 5.2.3 同位素信息分析方法 | 第62页 |
| 5.2.4 丙酮酸的位置同位素异构体分布计算方法 | 第62-64页 |
| 5.2.5 代谢通量分析 | 第64页 |
| 5.2.6 ~(13)C标记比例(FL)的计算 | 第64页 |
| 5.2.7 ~(13)C同位素标记实验 | 第64页 |
| 5.3 S.erythraea核心碳代谢网络模型的构建 | 第64-69页 |
| 5.3.1 S.erythraea核心碳代谢网络 | 第64-67页 |
| 5.3.2 S.erythraea代谢反应的原子迁移式 | 第67-68页 |
| 5.3.3 菌体合成反应 | 第68-69页 |
| 5.4 S.erythraea葡萄糖代谢分析 | 第69-71页 |
| 5.4.1 葡萄糖代谢过程中1号位标记的~(13)C在代谢途径中的去向 | 第69-70页 |
| 5.4.2 S. erythraea葡萄糖代谢分析结果 | 第70-71页 |
| 5.5 S.erythraea脯氨酸代谢分析 | 第71-77页 |
| 5.5.1 不同氨基酸对S.erythraea生长的影响 | 第71页 |
| 5.5.2 脯氨酸对于核心碳代谢的影响 | 第71-72页 |
| 5.5.3 验证~(13)C代谢通量分析的可靠性 | 第72-73页 |
| 5.5.4 脯氨酸对S. erythraea核心碳代谢的影响 | 第73-74页 |
| 5.5.5 ATP和辅酶代谢 | 第74-75页 |
| 5.5.6 脯氨酸代谢去向分析 | 第75-76页 |
| 5.5.7 脯氨酸对能荷的影响 | 第76-77页 |
| 5.6 本章小结 | 第77-78页 |
| 第6章 基于S.erythraea正丙醇代谢去向改造的基因工程菌构建及其对代谢的影响 | 第78-108页 |
| 6.1 引言 | 第78页 |
| 6.2 材料与方法 | 第78-88页 |
| 6.2.1 菌种 | 第78-79页 |
| 6.2.2 发酵培养基 | 第79页 |
| 6.2.3 菌体培养和检测方法 | 第79页 |
| 6.2.4 辅酶A类物质同位素信息分析方法 | 第79页 |
| 6.2.5 [1-~(13)C]丙酸钠标记实验 | 第79-80页 |
| 6.2.6 代谢通量计算方法 | 第80-82页 |
| 6.2.7 发酵过程中主要参数计算方法 | 第82页 |
| 6.2.8 制备E.coli的感受态细胞 | 第82-83页 |
| 6.2.9 E.coli感受态细胞的转化 | 第83页 |
| 6.2.10 核酸电泳以及回收纯化 | 第83页 |
| 6.2.11 DNA酶切和连接操作 | 第83-84页 |
| 6.2.12 PCR操作 | 第84-85页 |
| 6.2.13 PCR产物的纯化和质粒的抽提操作 | 第85-86页 |
| 6.2.14 S.erythraea E3菌株孢子的复苏和制备 | 第86页 |
| 6.2.15 S.erythraea总DNA的提取方法 | 第86-87页 |
| 6.2.16 测定S.erythraea E3对抗生素Kana、Apr和Tsr的天然抗性浓度 | 第87页 |
| 6.2.17 S. erythraea与E.coli的属间结合转移操作 | 第87-88页 |
| 6.2.18 挑选S.erythraea接合子 | 第88页 |
| 6.2.19 PCR扩增物测序前操作 | 第88页 |
| 6.3 红霉素发酵与正丙醇消耗 | 第88-92页 |
| 6.3.1 正丙醇代谢去向分析 | 第88-92页 |
| 6.4 S.erythraea E3菌株代谢改造 | 第92-99页 |
| 6.4.1 敲除S.erythraea E3中甲基丙二酰辅酶A变位酶基因 | 第93页 |
| 6.4.2 敲除S.erythraea E3中琥珀酰辅酶A合成酶基因(sucC) | 第93-99页 |
| 6.5 代谢改造对红霉素合成的影响 | 第99-100页 |
| 6.5.1 代谢改造菌株在摇瓶中的发酵特性研究 | 第99-100页 |
| 6.6 E3和E3-△mutB在5L发酵罐红霉素发酵过程中的宏观和微观代谢差异分析 | 第100-106页 |
| 6.6.1 E3和E3-△mutB发酵过程中宏观代谢参数分析 | 第101-103页 |
| 6.6.2 E3-AmutB发酵过程中的代谢通量分析 | 第103-106页 |
| 6.7 本章小结 | 第106-108页 |
| 第7章 高通量优化红霉素合成培养基 | 第108-120页 |
| 7.1 引言 | 第108页 |
| 7.2 材料与方法 | 第108-110页 |
| 7.2.1 菌种 | 第108页 |
| 7.2.2 红霉素生物检测培养基 | 第108页 |
| 7.2.3 48孔板培养 | 第108页 |
| 7.2.4 5L罐培养与培养基 | 第108页 |
| 7.2.5 单组分删除实验 | 第108页 |
| 7.2.6 Plackett-Burman实验设计 | 第108-110页 |
| 7.2.7 高通量生物法测定红霉素效价 | 第110页 |
| 7.3 应用高通量方法优化用于红霉素发酵的合成培养基 | 第110-114页 |
| 7.3.1 单组分删除实验结果 | 第110-113页 |
| 7.3.2 采用Plackett-Burman实验方法初步优化各组分浓度 | 第113-114页 |
| 7.4 利用氮、磷调控策略在5L罐中进一步优化合成培养基组分 | 第114-118页 |
| 7.5 优化的合成培养基与前期实验采用的合成培养基对比 | 第118-119页 |
| 7.6 本章小结 | 第119-120页 |
| 第8章 结论与展望 | 第120-123页 |
| 8.1 结论 | 第120-121页 |
| 8.2 创新点 | 第121页 |
| 8.3 展望 | 第121-123页 |
| 参考文献 | 第123-133页 |
| 致谢 | 第133-134页 |
| 在读期间主要成果 | 第134-135页 |
| 附录Ⅰ | 第135-138页 |
| 附录Ⅱ | 第138-143页 |
| 附录Ⅲ | 第143-146页 |
| 附录Ⅳ | 第146-148页 |
| 附录Ⅴ | 第148-150页 |
| 附录Ⅵ | 第150-152页 |
| 附录Ⅶ | 第152-155页 |
| 附件 | 第155页 |
