论文目录 | |
| 摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-8页 |
| 第一章 综述 | 第12-30页 |
| 1.1 碱基切除修复过程 | 第12-14页 |
| 1.2 碱基切除修复途径中的关键蛋白 | 第14-19页 |
| 1.2.1 FEN1的结构与功能 | 第15-17页 |
| 1.2.2 Polβ的结构与功能 | 第17-19页 |
| 1.3 碱基切除修复途径与DNA氧化、烷化损伤 | 第19-22页 |
| 1.4 碱基切除修复调控机制 | 第22-26页 |
| 1.4.1 蛋白质与蛋白质结合 | 第22-24页 |
| 1.4.2 蛋白质翻译后修饰 | 第24-26页 |
| 1.5 碱基切除修复与肿瘤的关系 | 第26-29页 |
| 1.5.1 FEN1与肿瘤的关系 | 第27-28页 |
| 1.5.2 Polβ与肿瘤的关系 | 第28-29页 |
| 1.6 本章小结 | 第29-30页 |
| 第二章 FEN1 378位精氨酸的甲基化调控其稳定性 | 第30-40页 |
| 2.1 引言 | 第30页 |
| 2.2 实验材料 | 第30-32页 |
| 2.2.1 实验所用细胞及DNA载体 | 第30页 |
| 2.2.2 实验所需相关溶液配制 | 第30-32页 |
| 2.3 实验方法与步骤 | 第32-34页 |
| 2.3.1 利用GST标签做原核蛋白的纯化 | 第32页 |
| 2.3.2 FEN1突变体的构建 | 第32-33页 |
| 2.3.3 体外甲基化反应 | 第33-34页 |
| 2.3.4 稳转细胞系的构建 | 第34页 |
| 2.3.5 数据分析 | 第34页 |
| 2.4 实验结果 | 第34-39页 |
| 2.4.1 PRMT1甲基化FEN1 | 第34-35页 |
| 2.4.2 FEN1与PRMT1之间存在相互结合 | 第35-36页 |
| 2.4.3 FEN1的378位精氨酸是其PRMT1甲基化位点 | 第36-38页 |
| 2.4.4 FEN1的378位甲基化不影响其FEN活力 | 第38-39页 |
| 2.5 本章小结 | 第39-40页 |
| 第三章 R152C Polβ突变体降低其碱基切除修复的效率并诱导细胞转化 | 第40-69页 |
| 3.1 引言 | 第40-41页 |
| 3.2 实验材料 | 第41-43页 |
| 3.2.1 实验所用细胞及DNA载体 | 第41页 |
| 3.2.2 实验所需相关溶液配制 | 第41-43页 |
| 3.3 实验方法与步骤 | 第43-52页 |
| 3.3.1 重组蛋白原核表达纯化 | 第43-44页 |
| 3.3.2 Polβ突变体的构建 | 第44页 |
| 3.3.3 稳转细胞系构建 | 第44-46页 |
| 3.3.4 蛋白免疫印迹(Western Blotting) | 第46-48页 |
| 3.3.5 DNA结合能力分析(DNA Binding Assay) | 第48页 |
| 3.3.6 Polβ聚合酶活力检测(DNA polymerase activity assay) | 第48-50页 |
| 3.3.7 体外重建碱基切除修复实验(Base excision repair assay) | 第50页 |
| 3.3.8 细胞敏感性实验(MMS and H_2O_2 sensitivity assay) | 第50页 |
| 3.3.9 免疫荧光(Immunofluorescence) | 第50-51页 |
| 3.3.10 核型分析 | 第51-52页 |
| 3.3.11 软琼脂克隆形成实验 | 第52页 |
| 3.3.12 数据分析 | 第52页 |
| 3.4 实验结果 | 第52-67页 |
| 3.4.1 在多种肿瘤细胞中发现Polβ的突变 | 第52-53页 |
| 3.4.2 R152C突变并不会影响Polβ蛋白的结构 | 第53-55页 |
| 3.4.3 R152C突变会削弱Polβ聚合酶活力 | 第55页 |
| 3.4.4 R152C突变未影响Polβ结合DNA的能力 | 第55-56页 |
| 3.4.5 R152C突变降低其碱基切除修复效率 | 第56-60页 |
| 3.4.6 R152C突变未影响Polβ与其它蛋白的相互作用 | 第60-61页 |
| 3.4.7 表达R152C Polβ的细胞表现出对DNA损伤药物更高的敏感性 | 第61-62页 |
| 3.4.8 表达R152C Polβ的细胞会产生较高频率的DNA双链断裂 | 第62-65页 |
| 3.4.9 表达R152C Polβ的细胞会出现更多染色体畸变 | 第65-66页 |
| 3.4.10 表达R152C Polβ的细胞具有更高的转化潜能 | 第66-67页 |
| 3.5 本章小结 | 第67-69页 |
| 第四章 R137Q Polβ突变体降低其碱基切除修复的效率并导致胚胎发育异常 | 第69-79页 |
| 4.1 引言 | 第69页 |
| 4.2 实验材料 | 第69-70页 |
| 4.2.1 实验所用细胞 | 第69页 |
| 4.2.2 实验所需相关溶液配制 | 第69-70页 |
| 4.3 实验方法与步骤 | 第70-71页 |
| 4.3.1 原代胚胎成纤维细胞(MEF)分离和培养 | 第70页 |
| 4.3.2 免疫组织化学实验 | 第70-71页 |
| 4.3.3 TUNEL实验 | 第71页 |
| 4.4 实验结果 | 第71-78页 |
| 4.4.1 R37Q Polβ Knock-in小鼠胚胎发育异常 | 第71-73页 |
| 4.4.2 R137Q小鼠胚胎细胞增殖较慢 | 第73页 |
| 4.4.3 R137Q小鼠胚胎细胞凋亡增加 | 第73-74页 |
| 4.4.4 R37Q小鼠胚胎组织及MEF细胞具有较低的碱基切除修复效率 | 第74-76页 |
| 4.4.5 R137Q小鼠胚胎组织和MEF细胞中出现DNA双链断裂的概率更高 | 第76-77页 |
| 4.4.6 R137Q小鼠MEF细胞中出现染色体断裂的概率更高 | 第77-78页 |
| 4.5 本章小结 | 第78-79页 |
| 第五章 讨论与总结 | 第79-83页 |
| 附录一 英文缩略词表 | 第83-84页 |
| 附录二 主要试剂及厂家 | 第84-86页 |
| 附录三 DNA引物及底物 | 第86-87页 |
| 参考文献 | 第87-99页 |
| 在读期间发表的学术论文及研究成果 | 第99-100页 |
| 致谢 | 第100页 |
