论文目录 | |
| 中文摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-11页 |
| 第一章 前言 | 第11-23页 |
| · 链霉菌 | 第11-12页 |
| · 抗生素 | 第12-13页 |
| · 链霉菌基因组及抗生素生物合成基因簇的组成特点 | 第13-14页 |
| · 链霉菌次生代谢调控系统 | 第14-16页 |
| · 美达霉素及其同族物 | 第16-17页 |
| · med-ORF 10与med-ORF 12 | 第17-20页 |
| · 链霉菌中常用的报告基因系统 | 第20-22页 |
| · 基于EGFP的报告基因系统 | 第20-21页 |
| · 以变铅青链霉菌产生的分泌型β-半乳糖苷酶为报告基因 | 第21页 |
| · 基于vibrio harveyi的luxAB基因的报告基因系统 | 第21-22页 |
| · 本项目的研究内容和意义 | 第22-23页 |
| 第二章 材料与方法 | 第23-37页 |
| · 菌株 | 第23-24页 |
| · 质粒 | 第24-25页 |
| · 培养基 | 第25-28页 |
| · 大肠杆菌培养基 | 第25页 |
| · 链霉菌培养基 | 第25-28页 |
| · 试剂和溶液 | 第28-31页 |
| · 大肠杆菌质粒提取试剂 | 第28页 |
| · 链霉菌DNA的提取 | 第28页 |
| · 链霉菌原生质体制备和转化试剂 | 第28页 |
| · 缓冲液 | 第28-29页 |
| · 其他试剂 | 第29页 |
| · 酶和生化试剂 | 第29-30页 |
| · 实验中所用的引物 | 第30-31页 |
| · 抗生素 | 第31页 |
| · 实验方法 | 第31-35页 |
| · 碱裂解法提取大肠杆菌质粒 | 第31-32页 |
| · 大肠杆菌感受态细胞中制备和转化 | 第32页 |
| · 链霉菌的培养 | 第32页 |
| · DNA体外操作 | 第32-33页 |
| · 链霉菌原生质体制备及转化 | 第33页 |
| · 链霉菌发酵和产物提取 | 第33页 |
| · LC/MS分析条件 | 第33-34页 |
| · 链霉菌RNA的提取步骤 | 第34-35页 |
| · RT-PCR第一步反应逆转录反应具体操作如下 | 第35页 |
| · 实验仪器及设备 | 第35-37页 |
| 第三章 med-ORF10基因在野生菌中的过量表达 | 第37-44页 |
| · 实验流程 | 第37-38页 |
| · 构建med-ORF10的过量表达菌株 | 第38-39页 |
| · 过量表达菌株AM-7161/pHSL98的分子水平验证 | 第39-40页 |
| · 过量表达菌株产素水平的研究 | 第40-41页 |
| · 发酵产物的粗提及HPLC(API-1100)分析 | 第41-43页 |
| · 讨论 | 第43-44页 |
| 第四章 通过半定量RT-PCR确定美达霉素基因簇中med-ORF10的调控靶基因 | 第44-52页 |
| · 实验具体流程 | 第44-45页 |
| · 菌株分子生物学验证 | 第45页 |
| · 初步确定美达霉素基因簇中受到med-ORF10调控的基因 | 第45-47页 |
| · CH999/pIK340和CH999/pAYT64总RNA的提取 | 第46页 |
| · 以RNA为模板进行cDNA的合成 | 第46-47页 |
| · 以cDNA为模板以特异性的引物进行PCR扩增 | 第47页 |
| · 实验结果 | 第47-50页 |
| · 23S rRNA内参的PCR扩增 | 第47-48页 |
| · med-ORF12的PCR扩增 | 第48-49页 |
| · 其它靶基因转录水平的研究----med-ORF11和med-ORF1的PCR扩增 | 第49页 |
| · 总结-异源野生菌株和异源突变菌的各基因在转录水平的表达差异 | 第49-50页 |
| · 讨论 | 第50-52页 |
| 第五章 Med-ORF10可能的调控靶点启动子活性初步分析 | 第52-61页 |
| · 实验流程 | 第52-53页 |
| · 美达霉素基因簇中主要靶基因med-ORF12可能启动子的预测 | 第53页 |
| · 含已知功能启动子的启动子探针质粒(阳性对照克隆)的构建及其在链霉菌AM-7161中GFP活性检测 | 第53-57页 |
| · 阳性对照质粒的原生质体转化及转化子的分子水平验证 | 第55-57页 |
| · 在AM-7161中检测阳性对照质粒上GFP的表达 | 第57页 |
| · P_(med-ORF12)启动子克隆构建及GFP活性检测 | 第57-60页 |
| · P_(med-ORF12)启动子克隆 | 第57-59页 |
| · 含P_(med-ORF12)片段的启动子探针质粒的构建 | 第59页 |
| · 启动子P_(med-ORF12)功能检测 | 第59-60页 |
| · 讨论 | 第60-61页 |
| 总结与展望 | 第61-63页 |
| 参考文献 | 第63-70页 |
| 硕士期间发表的论文 | 第70-71页 |
| 致谢 | 第71页 |
