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双重组菌耦合不对称还原生产(R)-或(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的研究

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双重组菌耦合不对称还原生产(R)-或(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的研究
论文目录
 
摘要第1-8 页
Abstract第8-18 页
前言第18-20 页
第一章 绪论第20-42 页
  1.1 手性化合物的重要性和研究现状第20-21 页
    1.1.1 手性化合物的重要性第20-21 页
    1.1.2 手性技术的研究现状第21 页
  1.2 制备手性化合物的主要方法第21-24 页
    1.2.1 手性拆分第22 页
    1.2.2 化学合成第22-23 页
    1.2.3 生物催化第23-24 页
  1.3 微生物催化手性合成的特点和优势第24-26 页
  1.4 生物催化β-羰基酯不对称还原反应研究进展第26-32 页
    1.4.1 微生物催化4-氯乙酰乙酸乙酯不对称合成的原理第27-28 页
    1.4.2 催化4-氯乙酰乙酸乙酯不对称还原的微生物第28-29 页
    1.4.3 酵母细胞中催化β-羰基酯不对称还原的酶第29-30 页
    1.4.4 生物催化4-氯乙酰乙酸乙酯不对称还原的方法第30 页
    1.4.5 影响微生物催化4-氯乙酰乙酸乙酯的因素第30-32 页
  1.5 不对称还原反应过程中的辅酶再生问题第32-34 页
    1.5.1 酶偶联法再生第32 页
    1.5.2 电化学法第32-33 页
    1.5.3 光化学法第33 页
    1.5.4 利用微生物细胞辅酶再生第33-34 页
  1.6 微生物催化4-氯乙酰乙酸乙酯还原反应的酶动力学第34-35 页
  1.7 本课题拟研究的内容第35 页
  参考文献第35-42 页
第二章 材料与方法第42-50 页
  2.1 试验材料第42-43 页
    2.1.1 质粒第42 页
    2.1.2 菌株第42 页
    2.1.3工具酶与试剂第42 页
    2.1.4 培养基第42-43 页
    2.1.5 主要仪器第43 页
  2.2 试验与分析方法第43-47 页
    2.2.1 分子克隆试验第43 页
    2.2.2 菌体浓度测定第43 页
    2.2.3 重组菌细胞超声破碎及胞内酶蛋白提取第43-44 页
    2.2.4 蛋白浓度测定第44 页
    2.2.5 SDS-PAGE电泳第44 页
    2.2.6 重组菌表达酶的比活性(specific activity)测定第44-46 页
    2.2.7 气/液相色谱测定底物和产物及e.e.值计算第46-47 页
    2.2.8 数据处理方法第47 页
  参考文献第47-50 页
第三章 醛基还原酶基因克隆、表达载体的构建及表达条件优化第50-66 页
  3.1 引言第50 页
  3.2 材料和方法第50-57 页
    3.2.1质粒第50-51 页
    3.2.2 菌株和培养基第51-52 页
    3.2.3 酶和试剂盒第52-53 页
    3.2.4 质粒提取和转化第53 页
    3.2.5 醛基还原酶(aldehyde reductase,ALR)基因的克隆与重组质粒的构建第53-56 页
    3.2.6 不同表达菌株的构建第56 页
    3.2.7 菌体培养及酶蛋白表达第56-57 页
    3.2.8 重组表达菌醛基还原酶活的测定第57 页
    3.2.9 重组菌株不对称还原反应体系第57 页
    3.2.10 细胞活性的检测第57 页
    3.2.11 产物气/液相检测及e.e.值第57 页
  3.3 结果与讨论第57-64 页
    3.3.1 不同转化子表达醛基还原酶活性测定第57-58 页
    3.3.2 重组菌株M15(pQE30-ALR)与原始酵母菌株酶活性比较及酶蛋白表达第58-60 页
    3.3.3 重组菌株M15(pQE30-ALR)培养条件和诱导条件的优化第60-64 页
  3.4 小结第64-65 页
  参考文献第65-66 页
第四章 重组大肠杆菌表达醛基还原酶不对称还原生产R-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的研究第66-78 页
  4.1 引言第66 页
  4.2 材料与方法第66-67 页
    4.2.1 试验材料第66-67 页
    4.2.2 试验方法第67 页
  4.3 结果与讨论第67-76 页
    4.3.1 重组菌表达醛基还原酶不对称还原COBE的反应特性第67-69 页
    4.3.2 辅酶再生对重组细胞催化COBE不对称还原反应的影响第69-70 页
    4.3.3 底物浓度对重组细胞不对称还原反应的影响第70-71 页
    4.3.4 产物浓度对重组细胞催化COBE不对称还原反应的影响第71-72 页
    4.3.5 pH值对重组细胞催化COBE不对称还原反应的影响第72-73 页
    4.3.6 反应温度对重组细胞催化COBE不对称还原反应的影响第73-74 页
    4.3.7 细胞密度对重组细胞催化COBE不对称还原反应的影响第74-75 页
    4.3.8 分批加入底物提高重组菌不对称还原反应的产率第75-76 页
  4.4 小结第76 页
  参考文献第76-78 页
第五章 重组菌高效表达葡萄糖脱氢酶及在还原型辅酶NADPH再生中的应用第78-96 页
  5.1 引言第78-79 页
  5.2 材料与方法第79-82 页
    5.2.1 试验试剂第79 页
    5.2.2 质粒与菌株第79 页
    5.2.3 培养基与培养条件第79-80 页
    5.2.4 葡萄糖脱氢酶基因的克隆第80-81 页
    5.2.5 葡萄糖脱氢酶表达载体的构建第81 页
    5.2.6 葡萄糖脱氢酶酶活力的测定第81-82 页
    5.2.7 还原型辅酶NADPH浓度的测定第82 页
    5.2.8 产物气相和液相色谱测定第82 页
  5.3 结果与讨论第82-93 页
    5.3.1 重组菌表达葡萄糖脱氢酶的性质第82-83 页
    5.3.2 克隆和重组表达的葡萄糖脱氢酶基因的测序及同源性分析第83-84 页
    5.3.3 重组菌表达葡萄糖脱氢酶酶比活性的测定第84-86 页
    5.3.4 重组菌M15(pQE30-gdh223)表达葡萄糖脱氢酶条件优化第86-88 页
    5.3.5 重组菌M15(pQE30-gdh223)实现辅酶的产生与再生第88-91 页
    5.3.6 重组菌M15(pQE30-gdh223)在生物催化不对称反应中的应用第91-93 页
  5.4 小结第93-94 页
  参考文献第94-96 页
第六章 重组菌E.coli M15(pQE30-gdh223)与E.coli M15(pQE30-ALR)耦合催化COBE不对称还原的研究第96-110 页
  6.1 引言第96 页
  6.2 材料和方法第96-97 页
    6.2.1 菌种第96-97 页
    6.2.2 培养基及培养方法第97 页
    6.2.3 酶活测定和细胞活性的研究第97 页
    6.2.4 不对称还原反应体系第97 页
    6.2.5 气相和液相色谱检测第97 页
  6.3 结果和讨论第97-107 页
    6.3.1 两重组菌耦合实现还原型辅酶再生的反应机理第97-99 页
    6.3.2 底物浓度和两种重组菌质量比对双菌耦合转化反应的影响第99-100 页
    6.3.3 反应温度对双菌耦合转化反应的影响第100-101 页
    6.3.4 葡萄糖浓度对双菌耦合转化反应的影响第101-102 页
    6.3.5 转速对双菌耦合转化反应的影响第102-103 页
    6.3.6 底物分批加入对提高双菌耦合转化率的影响第103-104 页
    6.3.7 两相体系双菌耦合转化COBE的研究第104-107 页
  6.4 小结第107-108 页
  参考文献第108-110 页
第七章 葡萄糖脱氢酶和醛基还原酶协同催化COBE不对称还原反应的酶动力学研究第110-128 页
  7.1 引言第110 页
  7.2 材料与方法第110-115 页
    7.2.1 试验试剂第110 页
    7.2.2 初酶提取与纯化第110 页
    7.2.3 酶蛋白浓度测定第110-111 页
    7.2.4 反应初速度测定第111 页
    7.2.5 产物气相和液相色谱检测第111 页
    7.2.6 数学模型的建立第111-115 页
  7.3 结果与讨论第115-122 页
    7.3.1 传质对酶的影响第115-116 页
    7.3.2 醛基还原酶催化COBE还原反应的动力学常数的确定第116-119 页
    7.3.3 葡萄糖脱氢酶催化COBE还原反应的动力学常数的确定第119-122 页
  7.4 双酶耦合辅酶循环再生催化COBE还原反应动力学第122-125 页
    7.4.1 双酶体系反应初速度的求解第123 页
    7.4.2 双酶的酶活性比对双酶体系转化效率的影响第123 页
    7.4.3 总辅酶浓度对双酶体系转化效率的影响第123-124 页
    7.4.4 对双酶体系辅酶随时间变化曲线的模拟第124-125 页
  7.5 小结第125 页
  参考文献第125-128 页
第八章 双菌耦合体系催化COBE不对称还原生产S-CHBE的研究第128-142 页
  8.1 引言第128-129 页
  8.2 材料和方法第129-131 页
    8.2.1 质粒、菌种和菌体培养第129 页
    8.2.2 工具酶和试剂盒第129 页
    8.2.3 羰基还原酶基因的克隆第129 页
    8.2.4 羰基还原酶表达载体的构建第129-130 页
    8.2.5 羰基还原酶酶活测定第130-131 页
    8.2.6 转化反应体系第131 页
    8.2.7 产物气相和液相检测第131 页
  8.3 结果与讨论第131-140 页
    8.3.1 培养基的优化第131 页
    8.3.2 诱导时间和诱导剂量的优化第131-132 页
    8.3.3 表达时间的确定第132-133 页
    8.3.4 重组菌与原始菌株比酶活的比较第133-134 页
    8.3.5 重组菌表达羰基还原酶不对称还原COBE的反应产物检测第134-135 页
    8.3.6 辅酶再生对重组菌E.coliM15(pQE30-CAR)不对称还原COBE的影响第135-136 页
    8.3.7 底物浓度对单菌转化及双菌耦合转化体系产率的影响第136-137 页
    8.3.8 E.coli M15(pQE30-CAR)及E.coli M15(pQE30-gdh223)质量比对产物得率的影响第137-138 页
    8.3.9 温度对双菌耦合转化反应的产率的影响第138 页
    8.3.10 两相体系分批补加菌体对双菌耦合转化反应产率的影响第138-140 页
  8.4 小结第140 页
  参考文献第140-142 页
结论第142-146 页
本论文符号表第146-147 页
攻读博士学位期间发表的论文第147-148 页
致谢第148 页

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