论文目录 | |
| 论文创新点 | 第11-13页 |
| 摘要 | 第13-15页 |
| Abstract | 第15-17页 |
| 技术路线 | 第17-18页 |
| 第一部分 文献综述 | 第18-49页 |
| 第一章 传染性法氏囊病病毒的研究现状 | 第18-30页 |
| 1 病毒学分类地位 | 第18页 |
| 2 基因组及编码蛋白 | 第18-24页 |
| 2.1 VP1蛋白 | 第19-20页 |
| 2.2 VP2蛋白 | 第20-21页 |
| 2.3 VP3蛋白 | 第21-22页 |
| 2.4 VP4蛋白 | 第22-23页 |
| 2.5 VP5蛋白 | 第23-24页 |
| 3 IBDV的复制机制和致病机理 | 第24-26页 |
| 3.1 IBDV的复制机制 | 第24-25页 |
| 3.1.1 IBDV的宿主细胞 | 第24页 |
| 3.1.2 病毒入侵 | 第24-25页 |
| 3.1.3 病毒复制、组装与释放 | 第25页 |
| 3.2 IBDV与细胞凋亡 | 第25-26页 |
| 4 IBDV与免疫应答 | 第26-27页 |
| 5 IBDV的毒力变异 | 第27-30页 |
| 第二章 ISG在抗病毒反应中的作用 | 第30-45页 |
| 1 干扰素的产生 | 第30-31页 |
| 2 ISG | 第31-45页 |
| 2.1 IFIT | 第31-37页 |
| 2.2 Viperin | 第37-40页 |
| 2.3 ISG15 | 第40-41页 |
| 2.4 PKR | 第41-42页 |
| 2.5 Mx | 第42-45页 |
| 第三章 病毒感染与细胞自噬 | 第45-49页 |
| 1 自噬的过程 | 第45-46页 |
| 2 自噬与病毒 | 第46-47页 |
| 3 自噬与凋亡 | 第47-49页 |
| 第二部分 研究内容 | 第49-106页 |
| 第一章 鸡IFIT5的克隆及特征分析 | 第49-73页 |
| 1 实验材料 | 第50-51页 |
| 1.1 主要仪器与设备 | 第50页 |
| 1.2 毒株、细胞和动物 | 第50页 |
| 1.3 试剂及材料 | 第50-51页 |
| 2 实验方法 | 第51-58页 |
| 2.1 生物信息学分析 | 第51页 |
| 2.2 质粒抽提 | 第51-52页 |
| 2.3 目的基因扩增 | 第52页 |
| 2.4 PCR产物纯化回收 | 第52-53页 |
| 2.5 双酶切及连接 | 第53页 |
| 2.6 感受态细胞制备 | 第53页 |
| 2.7 转化 | 第53-54页 |
| 2.8 原核蛋白表达与纯化 | 第54页 |
| 2.9 小鼠免疫及血清分离 | 第54-55页 |
| 2.10 RNA抽提与反转录 | 第55页 |
| 2.11 半定量RT-PCR | 第55-56页 |
| 2.12 细胞转染 | 第56页 |
| 2.13 干扰素刺激与Poly(I:C)转染 | 第56页 |
| 2.14 间接免疫荧光(IFA) | 第56页 |
| 2.15 Western blot分析 | 第56-57页 |
| 2.16 鸡IFIT5干扰 | 第57页 |
| 2.17 荧光定量PCR | 第57-58页 |
| 2.18 免疫共沉淀 | 第58页 |
| 2.19 dsRNA pull down实验 | 第58页 |
| 3 实验结果 | 第58-69页 |
| 3.1 鸡IFIT5的生物信息学分析 | 第58-59页 |
| 3.2 鸡IFIT5与其它物种IFIT5同源进化分析 | 第59-60页 |
| 3.3 鸡IFIT5在组织中的转录水平分析 | 第60-61页 |
| 3.4 鸡IFIT5原核蛋白的表达与纯化 | 第61-62页 |
| 3.5 鸡IFIT5多抗的制备及反应性检测 | 第62页 |
| 3.6 鸡IFIT5在细胞内的分布 | 第62-63页 |
| 3.7 鸡IFIT5可被干扰素和poly(I:C)诱导 | 第63-65页 |
| 3.8 鸡IFIT5影响IFN-β产生 | 第65-66页 |
| 3.9 鸡IFIT5与Mda5互作 | 第66-69页 |
| 4 讨论 | 第69-73页 |
| 第二章 IFIT5及Viperin对IBDV复制影响的研究 | 第73-94页 |
| 1 实验材料 | 第74-75页 |
| 1.1 主要仪器与设备 | 第74页 |
| 1.2 毒株、细胞和动物 | 第74-75页 |
| 1.3 试剂及材料 | 第75页 |
| 2 实验方法 | 第75-77页 |
| 2.1 细胞感染实验 | 第75页 |
| 2.2 动物感染实验 | 第75-76页 |
| 2.3 IBDV基因组抽提 | 第76页 |
| 2.4 超纯质粒抽提 | 第76页 |
| 2.5 荧光定量PCR | 第76页 |
| 2.6 Western blot | 第76页 |
| 2.7 IFA | 第76-77页 |
| 2.8 TCID_(50)测定 | 第77页 |
| 2.9 病毒基因组相对值测定 | 第77页 |
| 2.10 乳酸脱氢酶(LDH)活性测定 | 第77页 |
| 3 实验结果 | 第77-91页 |
| 3.1 IBDV感染DF-1细胞后IFIT5转录水平的动态分析 | 第77-79页 |
| 3.2 IBDV感染DF-1细胞后IFIT5蛋白水平的动态分析 | 第79-80页 |
| 3.3 IBDV感染可引起法氏囊组织中IFIT5上调表达 | 第80-81页 |
| 3.4 IBDV病毒蛋白VP1与基因组dsRNA可引起IFIT5上调表达 | 第81-83页 |
| 3.5 IFIT5与IBDV病毒蛋白不存在共定位 | 第83-84页 |
| 3.6 过表达IFIT5不影响IBDV在DF-1细胞内复制 | 第84-85页 |
| 3.7 干扰鸡IFIT5不影响IBDV在DF-1细胞复制 | 第85页 |
| 3.8 过表达人IFIT5不影响IBDV在293T细胞复制 | 第85-86页 |
| 3.9 IBDV感染DF-1细胞能够引起Viperin上调 | 第86-87页 |
| 3.10 Viperin与IBDV病毒蛋白无共定位 | 第87-88页 |
| 3.11 过表达鸡Viperin不影响IBDV在DF-1细胞复制 | 第88-89页 |
| 3.12 过表达人Viperin可抑制IBDV在293T细胞中复制 | 第89-90页 |
| 3.13 过表达人Viperin可引起细胞凋亡 | 第90-91页 |
| 4 讨论 | 第91-94页 |
| 第三章 IBDV病毒蛋白VP4调节细胞自噬的机制研究 | 第94-106页 |
| 1 实验材料 | 第95-96页 |
| 1.1 主要仪器与设备 | 第95页 |
| 1.2 细胞 | 第95页 |
| 1.3 试剂及材料 | 第95-96页 |
| 2 实验方法 | 第96页 |
| 2.1 细胞转染实验 | 第96页 |
| 2.2 IFA | 第96页 |
| 2.3 免疫共沉淀 | 第96页 |
| 2.4 Western Blot | 第96页 |
| 2.5 TUNEL实验 | 第96页 |
| 3 实验结果 | 第96-104页 |
| 3.1 VP4对自噬泡的影响分析 | 第96-97页 |
| 3.2 VP4不与LC3互作 | 第97-98页 |
| 3.3 VP4抑制细胞自噬 | 第98页 |
| 3.4 单磷酸化位点突变不影响VP4抑制自噬 | 第98-99页 |
| 3.5 VP4与Beclin-1共定位分析 | 第99页 |
| 3.6 单磷酸化位点突变不影响VP4与Beclin-1共定位 | 第99-100页 |
| 3.7 VP4与Beclin-1互作分析 | 第100-101页 |
| 3.8 VP4缺失C-末端两个氨基酸后可诱导细胞凋亡 | 第101-103页 |
| 3.9 VP4及其截短突变体的细胞毒性分析 | 第103-104页 |
| 4 讨论 | 第104-106页 |
| 全文总结 | 第106-107页 |
| 参考文献 | 第107-119页 |
| 附录 | 第119-127页 |
| 附录A 缩略词 | 第119-121页 |
| 附录B 常用缓冲液及培养基配方 | 第121-126页 |
| 附录C 攻读博士期间学术成果 | 第126-127页 |
| 致谢 | 第127页 |
