论文目录 | |
| 缩略词表 | 第11-13页 |
| 摘要 | 第13-15页 |
| Abstract | 第15-18页 |
| 1 文献综述 | 第18-37页 |
| 1.1 乳腺的生长发育 | 第18-20页 |
| 1.1.1 乳腺的结构 | 第18-19页 |
| 1.1.2 乳腺发育的过程 | 第19-20页 |
| 1.1.3 激素调控乳腺的发育 | 第20页 |
| 1.2 泌乳生物学 | 第20-26页 |
| 1.2.1 乳的生物学意义 | 第20-21页 |
| 1.2.2 乳腺的泌乳过程 | 第21-23页 |
| 1.2.3 乳分泌的调节 | 第23页 |
| 1.2.4 乳的组成及其功能 | 第23-26页 |
| 1.3 母猪乳腺发育及泌乳研究 | 第26-30页 |
| 1.3.1 猪乳腺发育 | 第26-27页 |
| 1.3.2 母猪泌乳研究 | 第27-30页 |
| 1.4 microRNA的研究进展 | 第30-35页 |
| 1.4.1 miRNA的发现 | 第30-31页 |
| 1.4.2 miRNA的命名 | 第31-32页 |
| 1.4.3 miRNA的生成 | 第32页 |
| 1.4.4 miRNA的作用机制 | 第32-33页 |
| 1.4.5 miRNA基本特征与分布 | 第33-34页 |
| 1.4.6 miRNA的靶基因预测和鉴定 | 第34-35页 |
| 1.5 本研究的目的和意义 | 第35-37页 |
| 2 利用测序技术分析金华猪和大约克猪泌乳期21天乳腺组织中microRNA的表达情况 | 第37-67页 |
| 2.1 材料与方法 | 第37-44页 |
| 2.1.1 实验材料 | 第37-38页 |
| 2.1.1.1 实验动物 | 第37页 |
| 2.1.1.2 主要仪器 | 第37页 |
| 2.1.1.3 主要试剂 | 第37-38页 |
| 2.1.2 实验方法 | 第38-44页 |
| 2.1.2.1 乳腺组织总RNA提取及检测 | 第38页 |
| 2.1.2.2 小RNA库构建 | 第38-42页 |
| 2.1.2.3 Illumina测序 | 第42页 |
| 2.1.2.4 测序数据分析 | 第42-44页 |
| 2.2 miRNAs的生物信息学分析 | 第44-45页 |
| 2.3 结果与分析 | 第45-60页 |
| 2.3.1 总RNA提取及质量检测 | 第45-46页 |
| 2.3.2 测序结果初步分析 | 第46-49页 |
| 2.3.2.1 测序序列的标准化 | 第46-47页 |
| 2.3.2.2 测序序列长度的分布分析 | 第47-49页 |
| 2.3.3 miRNA的分类鉴定 | 第49-50页 |
| 2.3.4 miRNA进化分析 | 第50-51页 |
| 2.3.5 染色体定位分析 | 第51-52页 |
| 2.3.6 miRNA的表达差异分析 | 第52-60页 |
| 2.3.6.1 差异表达的miRNA | 第52-53页 |
| 2.3.6.2 差异表达miRNA靶基因预测 | 第53-54页 |
| 2.3.6.4 KEGG分析pathway | 第54-60页 |
| 2.3.6.5 荧光定量验证测序结果 | 第60页 |
| 2.4 讨论 | 第60-67页 |
| 2.4.1 miRNA鉴定方法的选择 | 第60-61页 |
| 2.4.2 金华猪和大约克猪乳腺小RNA文库构建 | 第61-62页 |
| 2.4.3 miRNA的进阶分析 | 第62-63页 |
| 2.4.3.1 测序miRNA的分类 | 第62页 |
| 2.4.3.2 miRNA物种间的保守性 | 第62-63页 |
| 2.4.3.3 miRNA染色体上的分布特征 | 第63页 |
| 2.4.4 miRNA的表达差异分析 | 第63-67页 |
| 2.4.4.1 差异miRNA的表达分析 | 第63-64页 |
| 2.4.4.2 GO和KEGG分析 | 第64-65页 |
| 2.4.4.3 miRNA与乳腺发育及泌乳功能的关系 | 第65-67页 |
| 3 利用转录组测序技术(RNA-Seq)分析金华猪和大约克猪泌乳期21天乳腺组织中基因的表达情况 | 第67-88页 |
| 3.1 材料与方法 | 第67-70页 |
| 3.1.1 实验材料 | 第67-68页 |
| 3.1.1.1 实验动物 | 第67页 |
| 3.1.1.2 主要仪器 | 第67页 |
| 3.1.1.3 主要试剂 | 第67-68页 |
| 3.1.2 实验方法 | 第68-70页 |
| 3.1.2.1 RNA质量检测 | 第68页 |
| 3.1.2.2 mRNA的分离纯化和片段化 | 第68页 |
| 3.1.2.3 cDNA合成与末端修复 | 第68页 |
| 3.1.2.4 连接5’和3’接头 | 第68页 |
| 3.1.2.5 PCR扩增cDNA文库 | 第68-69页 |
| 3.1.2.6 Illumina Solexa测序 | 第69页 |
| 3.1.2.7 RNA-Seq数据分析 | 第69-70页 |
| 3.2 生物信息学分析 | 第70页 |
| 3.3 结果与分析 | 第70-85页 |
| 3.3.1 总RNA提取和质量检测 | 第70页 |
| 3.3.2 RNA-Seq基本数据分析结果 | 第70-71页 |
| 3.3.3 转录组装配、鉴定与比较 | 第71-74页 |
| 3.3.3.1 新预测的基因组信息与既有的参考基因组信息比较 | 第71-72页 |
| 3.3.3.2 新预测的的转录本、外显子和内含子大小的信息比较 | 第72-74页 |
| 3.3.4 基因表达水平分析 | 第74-85页 |
| 3.3.4.1 RPKM频数分析 | 第74-75页 |
| 3.3.4.2 样本间基因表达差异的韦氏图 | 第75-76页 |
| 3.3.4.3 差异基因表达分析 | 第76-77页 |
| 3.3.4.4 差异表达基因聚类分析 | 第77-79页 |
| 3.3.4.5 差异表达基因GO(Gene Ontology)注释和KEGG通路分析 | 第79-85页 |
| 3.4 讨论 | 第85-88页 |
| 3.4.1 高通量测序技术 | 第85-86页 |
| 3.4.2 差异表达基因的分析 | 第86-88页 |
| 4 猪乳腺组织乳腺发育及泌乳相关基因的表达研究 | 第88-102页 |
| 4.1 材料与方法 | 第88-94页 |
| 4.1.1 实验材料 | 第88页 |
| 4.1.1.1 实验动物 | 第88页 |
| 4.1.1.2 实验仪器 | 第88页 |
| 4.1.1.3 实验试剂 | 第88页 |
| 4.1.2 实验方法 | 第88-94页 |
| 4.1.2.1 乳腺组织石蜡切片准备 | 第88-89页 |
| 4.1.2.2 石蜡切片HE染色 | 第89页 |
| 4.1.2.3 免疫组化和免疫荧光 | 第89-91页 |
| 4.1.2.4 总RNA(含miRNA)提取步骤 | 第91页 |
| 4.1.2.5 引物合成 | 第91-92页 |
| 4.1.2.7 荧光定量PCR | 第92-94页 |
| 4.2 数据处理与统计分析 | 第94-95页 |
| 4.3 结果与分析 | 第95-99页 |
| 4.3.1 金华猪泌乳期乳腺组织石蜡切片HE染色观察 | 第95页 |
| 4.3.2 大约克乳腺上皮细胞标记蛋白鉴定 | 第95-96页 |
| 4.3.3 金华猪和大约克猪乳腺组织中功能基因表达差异比较 | 第96-97页 |
| 4.3.3.1 乳腺发育相关激素受体基因的表达水平比较 | 第96-97页 |
| 4.3.3.2 乳蛋白基因表达水平的比较 | 第97页 |
| 4.3.4 甲基化相关基因的差异表这 | 第97-98页 |
| 4.3.5 GHR和ER蛋白表达比较 | 第98页 |
| 4.3.6 乳腺相关microRNA的表达比较 | 第98-99页 |
| 4.4 讨论 | 第99-102页 |
| 4.4.1 激素调控乳腺的发育 | 第99-101页 |
| 4.4.2 miRNA对乳腺发育的调控 | 第101-102页 |
| 5 金华猪乳腺上皮细胞的培养 | 第102-114页 |
| 5.1 材料与方法 | 第102-108页 |
| 5.1.1 实验材料 | 第102-104页 |
| 5.1.1.1 实验动物 | 第102页 |
| 5.1.1.2 主要仪器 | 第102页 |
| 5.1.1.3 主要试剂 | 第102页 |
| 5.1.1.4 主要试剂配制 | 第102-103页 |
| 5.1.1.5 细胞培养器材的灭菌处理 | 第103-104页 |
| 5.1.2 实验方法 | 第104-108页 |
| 5.1.2.1 金华猪乳腺细胞的培养 | 第104-105页 |
| 5.1.2.2 乳腺上皮细胞HE染色观察 | 第105-106页 |
| 5.1.2.3 乳腺上皮细胞的冻存与复苏 | 第106页 |
| 5.1.2.4 乳腺上皮细胞蛋白marker鉴定 | 第106-107页 |
| 5.1.2.5 乳腺上皮细胞中miR-148a的过表达或抑制表达 | 第107-108页 |
| 5.1.2.6 转染后基因表达水平的检测 | 第108页 |
| 5.2 数据处理与统计分析 | 第108页 |
| 5.3 结果与分析 | 第108-112页 |
| 5.3.1 乳腺上皮细胞的培养 | 第108-109页 |
| 5.3.2 乳腺上皮细胞的复苏 | 第109-110页 |
| 5.3.3 乳腺上皮细胞的鉴定 | 第110页 |
| 5.3.4 猪miR-148a mimics和inhibitor在上皮细胞的转染表达 | 第110-111页 |
| 5.3.5 miR-148a过表达或低表达RT-PCR验证 | 第111-112页 |
| 5.3.6 转染后细胞中基因表达水平 | 第112页 |
| 5.4 讨论 | 第112-114页 |
| 6 结论、创新点及研究展望 | 第114-116页 |
| 6.1 结论 | 第114页 |
| 6.2 创新点 | 第114-115页 |
| 6.3 研究展望 | 第115-116页 |
| 参考文献 | 第116-123页 |
| 附录 | 第123-125页 |
| 博士期间论文发表 | 第125-126页 |
| 致谢 | 第126页 |
