论文目录 | |
| 摘要 | 第4-6页 |
| Summary | 第6-9页 |
| 英文缩略表 | 第9-15页 |
| 第一章 文献综述 | 第15-27页 |
| 1.1 PPR研究进展 | 第15-20页 |
| 1.1.1 PPR的流行病学特点 | 第15-16页 |
| 1.1.1.1 PPR的起源与分布 | 第15-16页 |
| 1.1.1.2 PPR的易感动物 | 第16页 |
| 1.1.2 PPRV分子病原学特点 | 第16-17页 |
| 1.1.2.1 病毒理化性质 | 第16页 |
| 1.1.2.2 PPRV病毒粒子的形态学结构 | 第16-17页 |
| 1.1.2.3 病毒基因组结构及其主要蛋白的作用 | 第17页 |
| 1.1.3 PPRV的复制 | 第17-18页 |
| 1.1.3.1 病毒的吸附和侵入 | 第17页 |
| 1.1.3.2 转录和复制 | 第17-18页 |
| 1.1.3.3 病毒的组装和释放 | 第18页 |
| 1.1.4 PPRV致病机理 | 第18-20页 |
| 1.1.4.1 PPRV感染过程 | 第18-19页 |
| 1.1.4.2 PPRV诱导细胞凋亡 | 第19页 |
| 1.1.4.3 PPRV引起细胞因子变化 | 第19页 |
| 1.1.4.4 PPRV的组织嗜性 | 第19-20页 |
| 1.2 SLAM受体研究进展 | 第20-27页 |
| 1.2.1 SLAM受体家族的结构与分布 | 第20-22页 |
| 1.2.2 SLAM受体的结构 | 第22-23页 |
| 1.2.3 SLAM受体的功能 | 第23页 |
| 1.2.4 SLAM受体V区蛋白 | 第23-24页 |
| 1.2.5 SLAM受体蛋白的表达 | 第24-27页 |
| 1.2.5.1 SLAM受体蛋白的原核表达 | 第24-25页 |
| 1.2.5.2 SLAM受体蛋白的真核表达 | 第25-27页 |
| 第二章 山羊SLAM／V区蛋白的原核表达与活性分析 | 第27-43页 |
| 2.1 材料和方法 | 第28-37页 |
| 2.1.1 菌种和载体 | 第28页 |
| 2.1.2 试剂与酶 | 第28页 |
| 2.1.3 培养基与溶液 | 第28-29页 |
| 2.1.4 SLAM/V基因原核克隆载体与原核表达载体的构建 | 第29-34页 |
| 2.1.4.1 SLAM/V基因引物设计 | 第29页 |
| 2.1.4.2 山羊外周血淋巴细胞的总RNA提取 | 第29-30页 |
| 2.1.4.3 RT-PCR扩增出SLAM/V基因序列 | 第30页 |
| 2.1.4.4 SLAM/V基因PCR产物的纯化 | 第30-31页 |
| 2.1.4.5 SLAM/V基因的克隆载体的构建 | 第31-32页 |
| 2.1.4.6 连接产物的转化 | 第32页 |
| 2.1.4.7 重组质粒阳性克隆的筛选和鉴定 | 第32页 |
| 2.1.4.8 pGEX-6P-1 载体质粒和pMD18-T/SLAM/V质粒的提取 | 第32-33页 |
| 2.1.4.9 目的片段与载体的双酶切与回收 | 第33-34页 |
| 2.1.4.10 重组质粒的连接 | 第34页 |
| 2.1.4.11 连接产物转化JM109感受态 | 第34页 |
| 2.1.4.12 重组质粒阳性克隆的筛选和鉴定 | 第34页 |
| 2.1.5 SLAM/V蛋白诱导表达的最佳时间的确定 | 第34-35页 |
| 2.1.6 SLAM/V蛋白诱导表达的最佳IPTG浓度的确定 | 第35页 |
| 2.1.7 SLAM/V蛋白的可溶性分析 | 第35页 |
| 2.1.8 SLAM/V蛋白的纯化 | 第35页 |
| 2.1.9 纯化后SLAM/V蛋白的Western-blot分析 | 第35-37页 |
| 2.1.9.1 表达产物纯化的蛋白先进行SDS-PAGE电泳 | 第35-36页 |
| 2.1.9.2 转膜 | 第36页 |
| 2.1.9.3 封闭与显色 | 第36-37页 |
| 2.2 结果 | 第37-41页 |
| 2.2.1 重组质粒的鉴定 | 第37-38页 |
| 2.2.1.1 重组质粒pMD18-T/SLAM/V的鉴定 | 第37页 |
| 2.2.1.2 重组质粒pGEX/SLAM/V的鉴定 | 第37-38页 |
| 2.2.2 SLAM/V蛋白的融合表达与活性分析 | 第38-41页 |
| 2.2.2.1 SLAM/V蛋白的融合表达 | 第38-39页 |
| 2.2.2.2 SLAM/V蛋白表达最佳诱导时间的优化 | 第39页 |
| 2.2.2.3 SLAM/V蛋白诱导表达最佳IPTG浓度的优化 | 第39-40页 |
| 2.2.2.4 SLAM/V蛋白的可溶性分析与蛋白纯化 | 第40页 |
| 2.2.2.5 纯化的SLAM/V蛋白的Western-blot分析 | 第40-41页 |
| 2.3 讨论 | 第41-43页 |
| 第三章 山羊SLAM／V区蛋白真核表达载体的构建与表达 | 第43-52页 |
| 3.1 材料和方法 | 第43-48页 |
| 3.1.1 菌种和载体 | 第43页 |
| 3.1.2 试剂与酶 | 第43-44页 |
| 3.1.3 培养基与溶液 | 第44页 |
| 3.1.4 SLAM/V基因真核表达载体的构建 | 第44-45页 |
| 3.1.4.1 pEGFP-N1载体质粒的提取 | 第44页 |
| 3.1.4.2 目的片段与载体的双酶切与回收 | 第44页 |
| 3.1.4.3 重组质粒的连接 | 第44-45页 |
| 3.1.4.4 连接产物进行转化JM109感受态 | 第45页 |
| 3.1.4.5 重组质粒阳性克隆的筛选和鉴定 | 第45页 |
| 3.1.5 大量提取无内毒素质粒pEGFP/SLAM/V | 第45-46页 |
| 3.1.6 重组质粒pEGFP/SLAM/V的真核表达与检测 | 第46-48页 |
| 3.1.6.1 重组质粒pEGFP/SLAM/V转染Vero细胞 | 第46-47页 |
| 3.1.6.2 Western blotting检测重组质粒pEGFP/SLAM/V在Vero细胞中的表达 | 第47-48页 |
| 3.2 结果 | 第48-50页 |
| 3.2.1 重组质粒pEGFP/SLAM/V的鉴定 | 第48-49页 |
| 3.2.2 重组质粒pEGFP/SLAM/V转染Vero细胞表达的鉴定 | 第49-50页 |
| 3.2.3 重组质粒pEGFP/SLAM/V转染Vero细胞后Western blotting鉴定 | 第50页 |
| 3.3 讨论 | 第50-52页 |
| 第四章 慢病毒介导的稳定表达山羊SLAM/V区蛋白的细胞系的建立 | 第52-69页 |
| 4.1 材料和方法 | 第52-60页 |
| 4.1.1 菌种、毒株和载体 | 第52-53页 |
| 4.1.2 试剂与酶 | 第53页 |
| 4.1.3 培养基与溶液 | 第53页 |
| 4.1.4 慢病毒表达载体的构建与鉴定 | 第53-55页 |
| 4.1.4.1 用于同源重组的引物设计 | 第53页 |
| 4.1.4.2 同源臂的SLAM/V基因的扩增与纯化 | 第53-54页 |
| 4.1.4.3 BP重组反应 | 第54页 |
| 4.1.4.4 BP重组质粒阳性克隆的筛选和鉴定 | 第54页 |
| 4.1.4.5 LR重组反应 | 第54-55页 |
| 4.1.4.6 LR重组质粒阳性克隆的筛选和鉴定 | 第55页 |
| 4.1.5 大量提取无内毒素质粒p DEST/SLAM/V、pLP1载体、pLP2载体、pLP/VSVG载体 | 第55页 |
| 4.1.6 慢病毒的包装 | 第55-56页 |
| 4.1.7 Vero细胞杀稻瘟菌素S全部致死浓度的确定 | 第56-57页 |
| 4.1.8 转基因亚克隆Vero细胞的筛选 | 第57页 |
| 4.1.9 转基因亚克隆Vero细胞基因组的PCR鉴定 | 第57-58页 |
| 4.1.10 转基因亚克隆Vero细胞的Western-blot鉴定 | 第58页 |
| 4.1.11 转基因亚克隆Vero细胞的间接免疫荧光鉴定 | 第58-59页 |
| 4.1.12 转基因亚克隆Vero细胞的接毒实验 | 第59-60页 |
| 4.1.12.1 PPRV Nig/75/1 疫苗株的接种与传代 | 第59页 |
| 4.1.12.2 real-time RT-PCR验证转基因亚克隆Vero细胞PPRV复制的增强效果 | 第59-60页 |
| 4.1.12.3 转基因亚克隆Vero细胞的细胞生长曲线测定与遗传稳定性 | 第60页 |
| 4.2 结果 | 第60-66页 |
| 4.2.1 同源重组阳性质粒的鉴定 | 第60-61页 |
| 4.2.1.1 BP重组质粒pDONR/SLAM/V的鉴定 | 第60页 |
| 4.2.1.2 LR重组质粒pDEST/SLAM/V的鉴定 | 第60-61页 |
| 4.2.2 Vero细胞杀稻瘟菌素S的最小致死浓度的确定 | 第61页 |
| 4.2.3 慢病毒的包装，感染Vero细胞与转基因单克隆的筛选 | 第61-62页 |
| 4.2.3.1 慢病毒的包装 | 第61页 |
| 4.2.3.2 感染Vero细胞与转基细胞的筛选 | 第61页 |
| 4.2.3.3 转基因亚克隆Vero细胞的筛选 | 第61-62页 |
| 4.2.4 转基因亚克隆Vero细胞的鉴定 | 第62-63页 |
| 4.2.4.1 转基因亚克隆Vero细胞的PCR鉴定 | 第62页 |
| 4.2.4.2 转基因亚克隆Vero细胞的Western-blot鉴定 | 第62-63页 |
| 4.2.4.3 转基因亚克隆Vero细胞的间接免疫荧光鉴定 | 第63页 |
| 4.2.5 Vero与Vero/SLAM/V细胞接种PPRV Nig/75/1 疫苗株的结果 | 第63-65页 |
| 4.2.5.1 Vero与Vero/SLAM/V细胞接种PPRV Nig/75/1 疫苗株的细胞病变观察 | 第63-64页 |
| 4.2.5.2 real-time RT-PCR验证PPRV在Vero/SLAM/V及vero细胞复制的增强效果 | 第64-65页 |
| 4.2.6 细胞生长曲线 | 第65-66页 |
| 4.3 讨论 | 第66-69页 |
| 全文结论 | 第69-70页 |
| 参考文献 | 第70-79页 |
| 致谢 | 第79-80页 |
| 作者简介 | 第80-81页 |
| 导师简介 | 第81-83页 |
