论文目录 | |
| 中文摘要 | 第1-8
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| 英文摘要 | 第8-10
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| 一 文献综述 | 第10-32
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| 1 番木瓜环斑病毒（PRSV）及其抗病策略 | 第10-17
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| · 前言 | 第10
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| · 番木瓜环斑病毒病 | 第10-12
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| · 症状 | 第11
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| · 病原 | 第11-12
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| · PRSV 分子生物学 | 第12
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| · PRSV 的抗病策略 | 第12-17
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| · 外壳蛋白(Coat Protein，CP)基因介导的抗性 | 第13-15
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| · 复制酶(replicase ,RP)基因介导的抗性 | 第15-16
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| · 运动蛋白(Movement Protein,MP)基因介导的抗性 | 第16-17
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| · 其他基因介导的抗性 | 第17
页 |
| 2 RNA 沉默（或称RNA 干扰）技术 | 第17-27
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| · RNA 沉默（或称RNA 干扰）技术理论基础及其可行性 | 第18
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| · RNAi 的可能形成机制 | 第18-21
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| · RNAi 表现特征 | 第21-22
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| · RNAi 是转录后水平的基因沉默机制 | 第21
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| · RNAi 具有很高的特异性 | 第21-22
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| · RNAi 抑制基因的表达依赖于dsRNA 剂量 | 第22
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| · RNAi 的干涉效应可以进行局部和系统性的扩散 | 第22
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| · RNAi 生物学意义 | 第22-24
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| · 调节基因表达和发育 | 第22-23
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| · 基因组免疫 | 第23-24
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| · 沉默的病毒抑制子 | 第24-26
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| · RNAi 技术的应用前景 | 第26-27
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| 3 花粉管通道技术 | 第27-30
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| · 花粉管通道法的起源与创立 | 第27-28
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| · 外源DNA 通过花粉管通道导入受体的验证 | 第28-29
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| · 待转基因种类和转化方法 | 第29-30
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| · 花粉管通道法转化率的影响因素 | 第30
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| · 利用花粉管通道法的优点 | 第30
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| 4 本研究的目的意义和技术路线 | 第30-32
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| · 目的意义 | 第30-31
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| · 技术路线 | 第31-32
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| 二 材料和方法 | 第32-43
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| 1 材料和试剂 | 第32
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| · 菌种和植物材料 | 第32
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| · 试剂 | 第32
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| · 主要仪器 | 第32
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| 2 方法 | 第32-43
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| · PRSV-CP 基因克隆 | 第32-37
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| · 总RNA 提取 | 第32-33
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| · RNA 纯度及完整性检测 | 第33
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| · PRSV-CP 引物设计 | 第33
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| · 反转录合成cDNA 第一链 | 第33-34
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| · RT-PCR 扩增 | 第34
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| · PCR 产物回收 | 第34-35
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| · 回收的PCR 片段与T-载体连接 | 第35
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| · 感受态细胞的制备 | 第35-36
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| · 重组质粒转化感受态细胞 | 第36
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| · 质粒酶切鉴定 | 第36-37
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| · PRSV-CP 基因序列比较 | 第37
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| · PRSV-CP 基因同源片段引物的设计与合成 | 第37-38
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| · PRSV-CP 基因同源片段的获得 | 第38
页 |
| · 正向、反向、正义链、反义链片段的获得 | 第38
页 |
| · 内含子片段的获得 | 第38
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| · 植物表达载体的构建 | 第38-40
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| · pBCP+、pBCP -表达载体的构建 | 第38-39
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| · p2301CP+、p2301-CP-表达载体的构建 | 第39
页 |
| · p2301CPU 载体的构建 | 第39
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| · p2301CPUL 表达载体的构建 | 第39-40
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| · 重组农杆菌工程菌株的获得及鉴定 | 第40-41
页 |
| · 农杆菌感受太细胞的制备 | 第40
页 |
| · 农杆菌EHA105 的转化 | 第40-41
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| · 筛选与鉴定 | 第41
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| · 花粉管介导番木瓜PRSV-CP 基因同源片段转化与果实的生长 | 第41-42
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| · 质粒直接导入技术 | 第41-42
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| · 质粒DNA 提取 | 第41
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| · 质粒的纯化 | 第41
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| · 质粒DNA 质量检测 | 第41
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| · 导入质粒DNA | 第41-42
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| · 菌液导入 | 第42
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| · 菌液准备 | 第42
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| · 导入菌液 | 第42
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| · 转基因植株检测 | 第42-43
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| · 番木瓜总DNA 提取 | 第42-43
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| · PCR 鉴定 | 第43
页 |
| 三 结果与分析 | 第43-53
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| 1 感病总RNA 电泳检测 | 第43-44
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| 2 RT-PCR 电泳检测 | 第44
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| 3 PRSV-CP 基因的酶切鉴定 | 第44-45
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| 4 我国番木瓜主要生产种植区的PRSV-CP 基因的序列比较分析 | 第45
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| 5 同源片段以及正向、反向，正义链、反义链的获得 | 第45
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| 6 内含子片段以及含内含子的正义链片段的获得 | 第45-47
页 |
| 7 植物表达载体构建 | 第47-49
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| · 含插入片段的中间克隆载体酶切鉴定 | 第47-48
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| · 植物表达载体的构建的酶切鉴定 | 第48-49
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| 8 重组农杆菌的鉴定 | 第49
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| 9 番木瓜转化座果率 | 第49-50
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| 10 转基因T1 代成株率 | 第50-51
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| 11PCR 检测 | 第51-53
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| 四 讨论 | 第53-58
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| 1 关于构建RNAi 植物表达载体的关键技术问题 | 第53
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| 2 花粉管通道技术在作物遗传改良中应用前景 | 第53-56
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| · 花粉管通道技术在作物遗传改良中的可行性 | 第53-54
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| · 质粒DNA 导入番木瓜的花粉管通道方法的建立 | 第54-55
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| · 花粉管通道转化技术需要进一步解决的问题 | 第55
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| · 花粉管通道技术在番木瓜生产上应用潜能 | 第55-56
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| 3 RNAi 技术在培育番木瓜广谱抗病育种中的效果预测 | 第56-58
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| · RNAi 技术在番木瓜中的应用潜能 | 第56
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| · 本研究已取得的工作成果对后续研究的重要影响 | 第56
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| · 下一步的研究工作计划 | 第56-58
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| 五 结论 | 第58-59
页 |
| 参考文献 | 第59-64
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| 附图 | 第64-71
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| 论文涉及的部分缩略词(Abbreviation) | 第71-72
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| 致谢 | 第72页 |
