论文目录 | |
| 致谢 | 第1-6页 |
| 中文摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-10页 |
| 缩略词 | 第10-15页 |
| 第一章 丙酮酸激酶缺失诱导人成纤维细胞衰老 | 第15-38页 |
| 1.1 实验试剂与仪器 | 第15-18页 |
| 1.1.1 材料和试剂 | 第15-16页 |
| 1.1.2 实验仪器及材料 | 第16页 |
| 1.1.3 相关试剂的配制 | 第16-18页 |
| 1.1.3.1 PBS溶液配制 | 第16-17页 |
| 1.1.3.2 LB培养基和LB平板的配制 | 第17页 |
| 1.1.3.3 SA-β-gal溶液的配制 | 第17页 |
| 1.1.3.4 人成纤维细胞或239FT细胞培养基配制 | 第17-18页 |
| 1.2 实验方法 | 第18-26页 |
| 1.2.1 人成纤维细胞的培养 | 第18页 |
| 1.2.2 细胞冻存 | 第18页 |
| 1.2.3 细胞复苏 | 第18页 |
| 1.2.4 质粒构建 | 第18-21页 |
| 1.2.5 质粒大量抽提 | 第21-22页 |
| 1.2.6 病毒包装 | 第22页 |
| 1.2.7 病毒感染 | 第22页 |
| 1.2.8 β-半乳糖苷酶染色 | 第22-23页 |
| 1.2.9 细胞增殖曲线 | 第23页 |
| 1.2.10 细胞周期检测 | 第23页 |
| 1.2.11 RNA提取及逆转录合成cDNA | 第23-24页 |
| 1.2.12 实时荧光定量PCR (real time PCR) | 第24页 |
| 1.2.13 Western Blot | 第24-26页 |
| 1.3 实验结果 | 第26-37页 |
| 1.3.1 检测PKM shRNA在人成纤维细胞的敲降效率 | 第26-28页 |
| 1.3.2 人成纤维细胞丙酮酸激酶表达降低后细胞衰老 | 第28-31页 |
| 1.3.3 shRNA沉默PKM激活DNA损伤反应(DDR)及p53-p21通路 | 第31-33页 |
| 1.3.4 shRNA沉默PKM使人成纤维细胞线粒体氧化应激增强 | 第33-35页 |
| 1.3.5 shRNA沉默后人成纤维细胞NAD~+无明显改变 | 第35-37页 |
| 1.4 讨论 | 第37-38页 |
| 第二章 丙酮酸激酶缺失影响人胚胎干细胞多能性 | 第38-45页 |
| 2.1 实验试剂与仪器 | 第38-39页 |
| 2.1.1 材料和试剂 | 第38页 |
| 2.1.2 实验仪器及材料 | 第38-39页 |
| 2.1.3 相关试剂的配制 | 第39页 |
| 2.2 实验方法 | 第39-41页 |
| 2.2.1 人胚胎干细胞的培养 | 第39-40页 |
| 2.2.2 碱性磷酸酶显色 | 第40-41页 |
| 2.3 实验结果 | 第41-44页 |
| 2.3.1 hESC丙酮酸激酶表达降低影响细胞多能性 | 第41-44页 |
| 2.4 讨论 | 第44-45页 |
| 第三章 丙酮酸激酶在线虫中的作用 | 第45-59页 |
| 引言 | 第45-47页 |
| 3.1 实验试剂与仪器 | 第47-48页 |
| 3.1.1 材料和试剂 | 第47页 |
| 3.1.2 实验仪器及材料 | 第47页 |
| 3.1.3 相关试剂的配制 | 第47-48页 |
| 3.1.3.1 NGM培养基配制 | 第47-48页 |
| 3.1.3.2 M9缓冲液 | 第48页 |
| 3.2 实验方法 | 第48-51页 |
| 3.2.1 sgRNA的设计与制备 | 第48-49页 |
| 3.2.2 template质粒的设计与制备 | 第49页 |
| 3.2.3 质粒转化 | 第49页 |
| 3.2.4 质粒大量抽提 | 第49页 |
| 3.2.5 显微注射 | 第49页 |
| 3.2.6 线虫基因组提取 | 第49-50页 |
| 3.2.7 线虫培养、冻存与复苏 | 第50-51页 |
| 3.3 实验结果 | 第51-58页 |
| 3.3.1 构建PYK1 GFP-Knockln strain与PYK2 GFP-Knockln strain | 第51-53页 |
| 3.3.2 线虫中PYK1与PYK2表达 | 第53-55页 |
| 3.3.3 构建PYK1 KnockOut strain | 第55-57页 |
| 3.3.4 PYK1 Knockout strain表型 | 第57-58页 |
| 3.4 讨论 | 第58-59页 |
| 参考文献 | 第59-63页 |
| 综述 糖代谢与细胞衰老的研究进展 | 第63-73页 |
| 参考文献 | 第67-73页 |
| 作者简历及在读期间的研究经历 | 第73页 |
