作者：吴鹏，田媛，桂伶俐，陈刚，卢运萍，周剑锋，马丁

【摘要】  目的针对smad4基因的不同部位,构建不同smad4 shRNA表达质粒载体,在转录后水平抑制smad4的表达,对其克隆进行鉴定并挑选出抑制效率最高的克隆。 方法 用DNA重组技术将针对人smad4基因不同部位所设计的3对shRNA序列克隆到真核表达质粒pGenesil1中,构建smad4 shRNA表达载体pGenesilsmad4shRNA1、2、3。脂质体介导转染人宫颈癌细胞株HeLa,经G418 筛选抑制smad4表达的稳定细胞克隆。结果3个smad4 shRNA 表达载体pGenesilsmad4shRNA1、2、3经限制性酶切及序列 分析 证明基因插入正确。RTPCR、Western blotting均证实: 3种shRNA重组质粒中pGenesilsmad4shRNA2可明显降低细胞内smad4 mRNA丰度及smad4蛋白表达。结论成功构建了smad4 shRNA表达载体pGenesilsmad4shRNA1、2、3,并筛选出特异而高效地阻断smad4表达的克隆。此实验结果为进一步 研究 smad4蛋白分子的生物学功能及 应用 奠定了基础。

【关键词】  宫颈癌; shRNA; smad4

　　Abstract：Objective To explore the feasibility of selective inhibiting smad4 expression using smad4 short hairpin RNA (shRNA) interference. MethodsThree 19bp reverse repeated motifs targeting of smad4 gene were synthesized and cloned into eukaryotic expression plasmid pGenesil1 containing U6 shRNA promoter and termination signal of RNA polymerase. The recombinant plasmids pGenesilshRNA1, 2, 3 and pGenesilcon were transfected into HeLa cells respectively by lipofectamine reagent. The alteration of smad4 expression was examined by RTPCR and Western blot. R……

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