论文目录 | |
| 缩略语表 | 第1-9页 |
| 中文摘要 | 第9-10页 |
| 英文摘要 | 第10-12页 |
| 前言 | 第12-16页 |
| 实验材料与仪器 | 第16-22页 |
| 1 菌株及细胞 | 第16页 |
| 2 基因组和质粒 | 第16页 |
| 3 培养基 | 第16-18页 |
| · E.coli培养基 | 第16-17页 |
| · 分杆杆菌培养基 | 第17页 |
| · 其他菌株药敏实验所用培养基 | 第17-18页 |
| · Vero和HepG2培养基 | 第18页 |
| 4 主要试剂 | 第18页 |
| 5 溶液 | 第18-20页 |
| · 抗生素溶液 | 第18-19页 |
| · 蛋白相关溶液 | 第19-20页 |
| 6 试剂盒 | 第20-21页 |
| 7 工具酶 | 第21页 |
| 8 主要仪器 | 第21-22页 |
| 实验方法 | 第22-43页 |
| 1 基于MTB的表型筛选 | 第22页 |
| · 化合库中样品的初筛 | 第22页 |
| · 化合物样品的拆分及复筛 | 第22页 |
| 2 MtIspD酶抑制剂的筛选 | 第22-35页 |
| · ispD基因的扩增 | 第22-24页 |
| · 表达载体的构建 | 第24-27页 |
| · 表达菌株的构建 | 第27-28页 |
| · MtIspD蛋白的诱导表达 | 第28页 |
| · MtIspD蛋白纯化及蛋白质含量测定 | 第28-30页 |
| · MtIspD蛋白的定量 | 第30页 |
| · MtIspD蛋白的SDS-PAGE电泳检测 | 第30-32页 |
| · MtIspD活性测定原理及方法 | 第32页 |
| · MtIspD酶活性测定体系优化 | 第32-33页 |
| · MtIspD抑制剂筛选模型的确立 | 第33-35页 |
| 3 抑制剂半数抑制浓度(IC_(50))测定 | 第35页 |
| 4 抑制剂的体外抗结核活性测定 | 第35-36页 |
| 5 抑制剂抗菌谱活性测定 | 第36页 |
| 6 化合物IMB-4901对MtIspD的动力学研究 | 第36页 |
| 7 化合物IMB-4901的细胞毒性研究 | 第36-37页 |
| 8 MtIspD可控表达菌株的构建 | 第37-43页 |
| · 构建MtIspD可控表达菌株的目的及意义 | 第37-38页 |
| · MtIspD可控表达质粒构建流程 | 第38页 |
| · ispD基因前320bp的获得 | 第38-39页 |
| · PCR产物的纯化 | 第39-40页 |
| · 纯化的PCR产物双酶切处理及回收 | 第40页 |
| · pAZI 9479的双酶切处理及片段回收 | 第40-41页 |
| · 酶切后ispD前320bp与pAZI9479连接 | 第41页 |
| · 连接产物转化DH5α感受态细胞 | 第41页 |
| · 阳性克隆鉴定 | 第41页 |
| · 阳性克隆质粒的提取 | 第41-42页 |
| · 重组质粒测序 | 第42页 |
| · 重组质粒pAZI 9479：：ispDqian320bp电转入H37Rv | 第42-43页 |
| 实验结果 | 第43-58页 |
| 1 基于MTB(H37Rv)表型筛选抗结核活性化合物 | 第43页 |
| 2 MtIspD酶抑制剂的筛选 | 第43-51页 |
| · 表达质粒pET28a(+)：：ispD的构建与验证 | 第43-45页 |
| · MtIspD蛋白的制备 | 第45-47页 |
| · 酶活力测定 | 第47-48页 |
| · 酶活测定体系的优化 | 第48-50页 |
| · MtIspD抑制剂筛选模型 | 第50页 |
| · MtIspD抑制剂的筛选 | 第50-51页 |
| 3 MtIspD抑制剂对H37Rv的最低抑菌浓度(MIC) | 第51-52页 |
| 4 MtIspD抑制剂的抗菌谱 | 第52-53页 |
| 5 化合物IMB-4901对MtIspD的抑制动力学研究 | 第53-54页 |
| 6 化合物IMB-4901对肝肾细胞毒性研究 | 第54-55页 |
| 7 MtIspD可控表达菌株的构建 | 第55-58页 |
| · ispD基因前320bp片段的获得 | 第55页 |
| · 纯化的PCR产物双酶切 | 第55页 |
| · pAZI 9479的双酶切 | 第55-56页 |
| · 阳性克隆菌落PCR鉴定 | 第56页 |
| · 重组质粒pAZI 9479：：ispDqian320bp测序 | 第56页 |
| · 重组质粒pAZI 9479：：ispDqian320bp电转入H37Rv | 第56-58页 |
| 讨论 | 第58-60页 |
| 结论 | 第60-61页 |
| 致谢 | 第61-62页 |
| 参考文献 | 第62-63页 |
| 文献综述 | 第63-76页 |
| 参考文献 | 第70-76页 |
| 附录 | 第76-78页 |
