论文目录 | |
| 摘要 | 第1-10页 |
| Abstract | 第10-12页 |
| 缩略词表 | 第12-13页 |
| 第一章 文献综述 | 第13-22页 |
| 1.1 牛多杀性巴氏杆菌病研究进展 | 第13页 |
| 1.2 牛多杀性巴氏杆菌病原学 | 第13-14页 |
| 1.2.1 牛多杀性巴氏杆菌培养及生化特性 | 第13页 |
| 1.2.2 多杀性巴氏杆菌分型 | 第13-14页 |
| 1.3 牛多杀性巴氏杆菌病的流行病学 | 第14页 |
| 1.4 牛多杀性巴氏杆菌病临床症状及病理变化 | 第14页 |
| 1.5 牛多杀性巴氏杆菌的致病机理 | 第14-18页 |
| 1.5.1 营养的获取 | 第14-15页 |
| 1.5.2 铁元素的摄取 | 第15页 |
| 1.5.3 菌体表面组分 | 第15-18页 |
| 1.5.3.1 脂多糖 | 第15页 |
| 1.5.3.2 荚膜 | 第15-16页 |
| 1.5.3.3 外膜蛋白 | 第16-17页 |
| 1.5.3.4 丝状血球凝集素蛋白 | 第17-18页 |
| 1.5.3.5 皮肤坏死毒素 | 第18页 |
| 1.6 牛多杀性巴氏杆菌病诊断技术 | 第18-19页 |
| 1.6.1 病原学诊断 | 第18页 |
| 1.6.2 分子生物学诊断 | 第18-19页 |
| 1.6.3 血清学诊断 | 第19页 |
| 1.7 转录组学研究进展 | 第19-20页 |
| 1.7.1 转录组学基本定义 | 第19页 |
| 1.7.2 转录组学的研究历程 | 第19-20页 |
| 1.7.3 多杀性巴氏杆菌的转录组学 | 第20页 |
| 1.8 研究的目的与意义 | 第20-22页 |
| 第二章 两株牛源荚膜A群脂多糖3型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定 | 第22-29页 |
| 引言 | 第22页 |
| 2.1 材料 | 第22-23页 |
| 2.1.1 病料及所用菌株 | 第22页 |
| 2.1.2 试剂耗材 | 第22页 |
| 2.1.3 培养基和试剂 | 第22-23页 |
| 2.1.4 实验动物 | 第23页 |
| 2.1.5 主要仪器 | 第23页 |
| 2.2 方法 | 第23-25页 |
| 2.2.1 病料和细菌涂片镜检 | 第23页 |
| 2.2.2 病原分离培养 | 第23页 |
| 2.2.3 生化鉴定 | 第23-24页 |
| 2.2.4 分离株致病性试验 | 第24页 |
| 2.2.5 16S rRNA基因测序 | 第24页 |
| 2.2.6 PCR鉴定细菌的种、荚膜群和脂多糖血清型 | 第24-25页 |
| 2.2.7 透明脂酸抑制试验鉴定荚膜A群Pm | 第25页 |
| 2.3 结果 | 第25-27页 |
| 2.3.1 涂片镜检 | 第25页 |
| 2.3.2 分离菌培养特征和生化鉴定 | 第25-26页 |
| 2.3.3 分离株回归小鼠的致病力 | 第26页 |
| 2.3.4 16S rRNA基因测序 | 第26页 |
| 2.3.5 PCR鉴定Pm种、荚膜分群和脂多糖基因型 | 第26页 |
| 2.3.6 荚膜A群透明脂酸抑制实验 | 第26-27页 |
| 2.4 讨论 | 第27-29页 |
| 第三章 多杀性巴氏杆菌A、B型菌株转录组学分析 | 第29-41页 |
| 引言 | 第29页 |
| 3.1 材料 | 第29-30页 |
| 3.1.1 菌株 | 第29页 |
| 3.1.2 试剂耗材 | 第29页 |
| 3.1.3 培养基和试剂 | 第29-30页 |
| 3.1.4 主要仪器设备 | 第30页 |
| 3.2 实验方法 | 第30-33页 |
| 3.2.1 细菌培养与样品准备 | 第30页 |
| 3.2.2 RNA提取与质量检测 | 第30页 |
| 3.2.3 测序文库构建 | 第30页 |
| 3.2.4 测序及数据分析 | 第30-32页 |
| 3.2.4.1 数据质量控制 | 第31页 |
| 3.2.4.2 基因比对分析 | 第31页 |
| 3.2.4.3 基因表达及基因差异表达分析 | 第31页 |
| 3.2.4.4 差异表达基因GO功能分析 | 第31页 |
| 3.2.4.5 基因KEGG富集分析 | 第31-32页 |
| 3.2.5 荧光定量PCR验证 | 第32-33页 |
| 3.3 结果 | 第33-39页 |
| 3.3.1 转录组质量控制及基因组比对 | 第33页 |
| 3.3.2 基因表达水平分析 | 第33-34页 |
| 3.3.3 差异表达基因GO功能分析 | 第34-35页 |
| 3.3.4 基因KEGG代谢通路分析 | 第35-38页 |
| 3.3.5 Real-timePCR验证转录组测序准性 | 第38-39页 |
| 3.4 讨论 | 第39-41页 |
| 第四章 牛源多杀性巴氏杆菌优势抗原LolB筛选,表达及纯化 | 第41-57页 |
| 引言 | 第41页 |
| 4.1 材料 | 第41-44页 |
| 4.1.1 菌株及质粒 | 第41页 |
| 4.1.2 实验动物 | 第41页 |
| 4.1.3 试剂耗材 | 第41-42页 |
| 4.1.4 培养基和试剂配制 | 第42-44页 |
| 4.1.4.1 细菌培养基 | 第42页 |
| 4.1.4.2 SDS-PAGE电泳及WesternBlot相关试剂 | 第42页 |
| 4.1.4.3 琼脂糖凝胶电泳相关试剂 | 第42-43页 |
| 4.1.4.4 Pull-down相关试剂 | 第43页 |
| 4.1.4.5 蛋白纯化相关试剂 | 第43-44页 |
| 4.1.5 主要仪器设备 | 第44页 |
| 4.2 实验方法 | 第44-51页 |
| 4.2.1 兔高免血清制备 | 第44页 |
| 4.2.2 免疫沉淀实验(pull-down)所用抗体及抗原复合物制备 | 第44-45页 |
| 4.2.2.1 多杀性巴氏杆菌血清纯化IgG | 第44-45页 |
| 4.2.2.2 牛多杀性巴氏杆菌抗原复合物的制备 | 第45页 |
| 4.2.2.3 琼脂扩散试验 | 第45页 |
| 4.2.3 Pull-down筛选牛多杀性巴氏杆菌优势抗原 | 第45-46页 |
| 4.2.3.1 Pull-down方法分离菌体蛋白 | 第45-46页 |
| 4.2.3.2 SDS-PAGE凝胶电泳分析 | 第46页 |
| 4.2.3.3 特异条带的切割、保存及质谱分析 | 第46页 |
| 4.2.4 牛多杀性巴氏杆菌优势抗原LolB的表达与纯化 | 第46-51页 |
| 4.2.4.1 牛多杀性巴氏杆菌全基因组的提取 | 第46-47页 |
| 4.2.4.2 牛多杀性巴氏杆菌LolB基因的克隆 | 第47-48页 |
| 4.2.4.3 牛多杀性巴氏杆菌LolB原核表达载体的构建 | 第48-49页 |
| 4.2.4.4 pET-28a-LolB、pMAL-LolB的诱导表达与可溶性鉴定 | 第49页 |
| 4.2.4.5 His-LolB与MBP-LolB重组蛋白的鉴定 | 第49-50页 |
| 4.2.4.6 MBP-LolB重组蛋白的纯化 | 第50-51页 |
| 4.3 实验结果与分析 | 第51-56页 |
| 4.3.1 Pull-down所用抗体及抗原复合物制备 | 第51-52页 |
| 4.3.1.1 荚膜A、B群P.multocida血清纯化IgG | 第51页 |
| 4.3.2.2 琼脂扩散实验 | 第51-52页 |
| 4.3.2 Pull-down探寻P.multocida优势抗原 | 第52页 |
| 4.3.2.1 Pull-down探寻P.multocida优势抗原 | 第52页 |
| 4.3.2.2 特异条带的质谱鉴定 | 第52页 |
| 4.3.3 牛多杀性巴氏杆菌优势抗原LolB表达与纯化 | 第52-56页 |
| 4.3.3.1 牛多杀性巴氏杆菌全基因组提取 | 第52-53页 |
| 4.3.3.2 牛多杀性巴氏杆菌LolB基因的克隆 | 第53页 |
| 4.3.3.3 His-LolB与MBP-LolB表达载体构建 | 第53-54页 |
| 4.3.3.4 pET28a-LolB与pMAL-LolB的诱导表达 | 第54-55页 |
| 4.3.3.5 His-LolB与MBP-LolB重组蛋白鉴定 | 第55页 |
| 4.3.3.6 MBP-LolB重组蛋白纯化 | 第55-56页 |
| 4.4 讨论 | 第56-57页 |
| 第五章 检测多杀性巴氏杆菌LolB抗体的间接ELISA的建立及初步应用 | 第57-64页 |
| 引言 | 第57页 |
| 5.1 材料 | 第57-58页 |
| 5.1.1 血清 | 第57页 |
| 5.1.2 试剂耗材 | 第57-58页 |
| 5.1.3 主要仪器 | 第58页 |
| 5.1.4 ELISA相关试剂 | 第58页 |
| 5.2 方法 | 第58-59页 |
| 5.2.1 确定抗原包被浓度及血清最佳稀释度 | 第58-59页 |
| 5.2.2 最佳封闭液的选择 | 第59页 |
| 5.2.3 HRP-兔抗牛IgG稀释液的确定 | 第59页 |
| 5.2.4 间接ELISA判定标准的确定 | 第59页 |
| 5.2.5 特异性试验 | 第59页 |
| 5.2.6 敏感性试验 | 第59页 |
| 5.2.7 重复性试验 | 第59页 |
| 5.3 结果 | 第59-62页 |
| 5.3.1 最佳抗原包被浓度及血清稀释度的确定 | 第59-60页 |
| 5.3.2 最佳封闭液的选择 | 第60页 |
| 5.3.3 最佳HRP-兔抗牛IgG浓度的选择 | 第60-61页 |
| 5.3.4 间接ELISA判定标准 | 第61页 |
| 5.3.5 特异性实验结果 | 第61页 |
| 5.3.6 敏感性试验 | 第61-62页 |
| 5.3.7 重复性试验 | 第62页 |
| 5.4 讨论 | 第62-64页 |
| 全文总结 | 第64-65页 |
| 参考文献 | 第65-74页 |
| 致谢 | 第74-75页 |
| 作者简历 | 第75页 |
