论文目录 | |
| 摘要 | 第1-6
页 |
| Abstract | 第6-8
页 |
| 1 文献综述 | 第8-18
页 |
| 1．1 病原学历史 | 第8-9
页 |
| 1．2 病毒的生物学特性 | 第9-10
页 |
| 1．2．1 病毒的理化性质 | 第9
页 |
| 1．2．2 病毒的复制方式及培养特性 | 第9-10
页 |
| 1．3 分子生物学研究进展 | 第10-14
页 |
| 1．3．1 基因组的分子结构 | 第10-13
页 |
| 1．3．2 Rep蛋白 | 第13-14
页 |
| 1．3．3 Cap蛋白 | 第14
页 |
| 1．4 PCV对免疫系统的影响 | 第14-16
页 |
| 1．4．1 自然感染或实验感染 PCV后淋巴组织的变化 | 第14-15
页 |
| 1．4．2 PCV2自然感染猪外周血淋巴细胞亚类的变化 | 第15-16
页 |
| 1．5 分子生物学检测方法的研究进展 | 第16-18
页 |
| 1．5．1 酶联免疫吸附实验(ELISA) | 第16
页 |
| 1．5．2 PCR检测方法 | 第16-17
页 |
| 1．5．3 原位核酸杂交试验(ISH) | 第17-18
页 |
| 2 研究目的与意义 | 第18-19
页 |
| 3 材料与方法 | 第19-27
页 |
| 3．1 材料 | 第19-20
页 |
| 3．1．1 细胞、菌株、载体及病料 | 第19
页 |
| 3．1．2 酶及其它试剂 | 第19
页 |
| 3．1．3 主要溶液和培养基 | 第19-20
页 |
| 3．2 方法 | 第20-27
页 |
| 3．2．1 引物设计与合成 | 第20
页 |
| 3．2．2 病料 PCR反应模板的制备 | 第20-21
页 |
| 3．2．3 感受态细胞的制备、质粒的转化、质粒制备与纯化 | 第21
页 |
| 3．2．4 质粒的少量制备(碱裂解法) | 第21-22
页 |
| 3．2．5 质粒的大量制备(碱裂解法) | 第22
页 |
| 3．2．6 病料 PCR扩增反应 | 第22-23
页 |
| 3．2．7 PCR产物的回收 | 第23
页 |
| 3．2．8 PCR产物克隆至 T载体 | 第23
页 |
| 3．2．9 重组质粒 T-PCV2的鉴定和序列测定 | 第23
页 |
| 3．2．10 病毒的培养增殖 | 第23-24
页 |
| 3．2．11 病毒的形态观察 | 第24
页 |
| 3．2．12 PCV1-ORF2基因的扩增、克隆 | 第24
页 |
| 3．2．13 重组质粒 SK-PCV2的构建 | 第24
页 |
| 3．2．14 SK- PCV2△ORF2基因的扩增及重组质粒 SK-PCV2-1的构建 | 第24
页 |
| 3．2．15 二联体质粒 SK-PCV2-1(DB)的构建 | 第24-25
页 |
| 3．2．16 制备抗 PCV1 ORF2阳性血清 | 第25-26
页 |
| 3．2．17 脂质体介导 DNA转染真核细胞和间接免疫荧光试验(IFA) | 第26
页 |
| 3．2．18 以RT-PCR方法检测转染细胞中的mRNA | 第26-27
页 |
| 4 结果与分析 | 第27-35
页 |
| 4．1 病料中的 PCV2检测与病毒分离 | 第27
页 |
| 4．2 病毒纯化与电镜观察 | 第27
页 |
| 4．3 PCV2分离株全基因组的克隆 | 第27-28
页 |
| 4．4 HeNan-PCV2分离株的全基因组序列分析 | 第28-30
页 |
| 4．5 SK-PCV2△ORF2及 ORF2-PCV1基因扩增结果 | 第30-31
页 |
| 4．6 重组质粒的酶切鉴定 | 第31-33
页 |
| 4．7 pEGFP-ORF2-PCV1转染细胞观察 | 第33
页 |
| 4．8 SK-PCV2-1( DB)转染细胞的 RT-PCR结果 | 第33-34
页 |
| 4．9 间接免疫荧光(IFA)检测结果 | 第34-35
页 |
| 5 讨论 | 第35-38
页 |
| 5．1 引物的设计 | 第35
页 |
| 5．2 病毒的分离纯化 | 第35-36
页 |
| 5．3 PCV2分离株全基因组序列分析 | 第36
页 |
| 5．4 PCV1 ORF2基因在真核细胞中的表达与定位 | 第36-37
页 |
| 5．5 PCV2-1感染性克隆的构建策略 | 第37-38
页 |
| 6 总结 | 第38-39
页 |
| 参考文献 | 第39-45
页 |
| 致谢 | 第45
页 |
