论文目录 | |
| 缩略语表 | 第1-8页 |
| 中文摘要 | 第8-11页 |
| Abstract | 第11-14页 |
| 前言 | 第14-16页 |
| 文献回顾 | 第16-23页 |
| 第一部分 pSVK-HBVA 细胞免疫学初步检测 | 第23-35页 |
| 1 实验材料 | 第23-25页 |
| 1.1 菌株、质粒和实验动物 | 第23页 |
| 1.2 酶和试剂 | 第23-24页 |
| 1.3 主要溶液及配置 | 第24-25页 |
| 1.4 主要仪器设备 | 第25页 |
| 2 实验方法 | 第25-29页 |
| 2.1 大量提取与纯化免疫用质粒 DNA | 第25-26页 |
| 2.2 免疫分组与免疫方案 | 第26-27页 |
| 2.3 免疫小鼠脾脏淋巴细胞悬液的制备 | 第27页 |
| 2.4 ELISPOT 法检测免疫小鼠脾淋巴细胞的 IFN-γ分泌 | 第27-28页 |
| 2.5 免疫小鼠脾脏淋巴细胞的增殖 | 第28页 |
| 2.6 免疫小鼠脾脏淋巴细胞的细胞因子释放实验 | 第28-29页 |
| 2.7 统计学处理 | 第29页 |
| 3 实验结果 | 第29-33页 |
| 3.1 免疫质粒大提后的酶切鉴定 | 第29-30页 |
| 3.2 ELISPOT 检测免疫小鼠 IFN-γ的分泌 | 第30-31页 |
| 3.3 免疫小鼠脾淋巴细胞的增殖 | 第31-32页 |
| 3.4 免疫小鼠脾淋巴细胞的细胞因子释放检测 | 第32-33页 |
| 4．讨论 | 第33-35页 |
| 第二部分 重组质粒 pIRES-neo-HBAg 的构建 | 第35-50页 |
| 1 实验材料 | 第35-37页 |
| 1.1 菌株和质粒 | 第35页 |
| 1.2 酶和试剂 | 第35-36页 |
| 1.3 主要溶液及配置 | 第36页 |
| 1.4 主要仪器设备 | 第36-37页 |
| 2 实验方法 | 第37-44页 |
| 2.1 引物的设计与合成 | 第37页 |
| 2.2 HBAg 融合基因的扩增 | 第37-38页 |
| 2.3 PCR 扩增产物的琼脂糖凝胶电泳 | 第38页 |
| 2.4 PCR 扩增产物的切胶纯化 | 第38页 |
| 2.5 纯化回收的 HBAg 片段连入过渡载体 pMD18-T | 第38-39页 |
| 2.6 连接产物的转化 | 第39页 |
| 2.7 pMD18-T-HBAg 质粒的小量提取 | 第39-40页 |
| 2.8 阳性重组质粒 pMD18-T-HBAg 的酶切鉴定 | 第40-41页 |
| 2.9 纯化回收测序正确的 HBAg 片段 | 第41页 |
| 2.10 pIRES-neo 载体片段的双酶切与纯化回收 | 第41-42页 |
| 2.11 HBAg 片段与 pIRES-neo 载体的连接 | 第42页 |
| 2.12 连接产物的转化 | 第42-43页 |
| 2.13 菌落的 PCR 快速初步鉴定 | 第43页 |
| 2.14 连接产物 pIRES-neo-HBAg 质粒的小量提取 | 第43-44页 |
| 2.15 阳性重组质粒 pIRES-neo-HBAg 的酶切鉴定与测序 | 第44页 |
| 3 实验结果 | 第44-47页 |
| 3.1 利用 PCR 技术扩增 HBAg 融合抗原基因 | 第44-45页 |
| 3.2 重组质粒 pMD18-T-HBAg 的双酶切鉴定 | 第45页 |
| 3.3 酶切产物 HBAg 的测序鉴定 | 第45-46页 |
| 3.4 pIRES-neo-PSCA 质粒的双酶切及 pIRES-neo 载体片段的回收 | 第46页 |
| 3.5 重组真核表达质粒 pIRES-neo-HBAg 构建与双酶切鉴定 | 第46-47页 |
| 3.6 重组真核表达质粒 pIRES-neo-HBAg 的序列测定 | 第47页 |
| 4．讨论 | 第47-50页 |
| 第三部分 重组质粒 pIRES-neo-HBAg 的体外表达和稳定转染 Hepa1-6 混合克隆细胞株的初步筛选 | 第50-64页 |
| 1.实验材料 | 第50-51页 |
| 1.1 细胞和质粒 | 第50页 |
| 1.2 主要试剂和抗体 | 第50页 |
| 1.3 主要仪器设备 | 第50-51页 |
| 2 实验方法 | 第51-58页 |
| 2.1 无内毒素重组质粒 pIRES-neo-HBAg 的提取 | 第51-52页 |
| 2.2 重组质粒 pIRES-neo-HBAg 瞬时转染 293T 细胞 | 第52页 |
| 2.3 Western blot 检测 HBV 融合抗原的表达 | 第52-55页 |
| 2.4 流式细胞术分析重组质粒瞬时转染的 293T 细胞 | 第55页 |
| 2.5 免疫荧光检测重组质粒瞬时转染的 293T 细胞 | 第55-56页 |
| 2.6 Hepa1-6 细胞的培养 | 第56页 |
| 2.7 重组质粒 pIRES-neo-HBAg 转染 Hepa1-6 细胞 | 第56页 |
| 2.8 筛选药物 G418 的配置 | 第56页 |
| 2.9 Hepa1-6 细胞的 G418 最低致死浓度的确定 | 第56-57页 |
| 2.10 HBV 融合抗原转染 Hepa1-6 细胞后的加压筛选 | 第57页 |
| 2.11 稳定转染混合克隆细胞株的表达能力检测 | 第57-58页 |
| 3 实验结果 | 第58-62页 |
| 3.1 Western blot 检测结果 | 第58页 |
| 3.2 流式细胞术检测瞬时转染 293T 细胞结果 | 第58-60页 |
| 3.3 免疫荧光法检测瞬时转染 293T 细胞 | 第60页 |
| 3.4 G418 的最佳筛选浓度和维持浓度的确定 | 第60页 |
| 3.5 稳定转染 HBV 融合抗原的混合克隆细胞株的显微镜观察 | 第60-61页 |
| 3.6 流式细胞术检测混合克隆细胞株 HBV 融合抗原的表达 | 第61页 |
| 3.7 Western blot 检测结果 | 第61-62页 |
| 4．讨论 | 第62-64页 |
| 总结 | 第64-65页 |
| 参考文献 | 第65-70页 |
| 个人简历和研究成果 | 第70-71页 |
| 致谢 | 第71页 |
