论文目录 | |
| 致谢 | 第1-10页 |
| 英文缩写词表 | 第10-11页 |
| 摘要 | 第11-13页 |
| 文献综述 | 第13-25页 |
| 1 鸭源鸡杆菌 | 第13-18页 |
| 1.1 鸭源鸡杆菌分类地位的确立 | 第13页 |
| 1.2 鸭源鸡杆菌致病性 | 第13-15页 |
| 1.3 鸭源鸡杆菌主要毒力因子 | 第15-18页 |
| 1.3.1 RTX样毒素GtxA | 第15页 |
| 1.3.2 菌毛 | 第15-16页 |
| 1.3.3 外膜囊泡 | 第16页 |
| 1.3.4 荚膜 | 第16-17页 |
| 1.3.5 金属蛋白酶 | 第17页 |
| 1.3.6 生物被膜 | 第17页 |
| 1.3.7 血凝素 | 第17-18页 |
| 2 外膜蛋白 | 第18-22页 |
| 2.1 概述 | 第18-19页 |
| 2.2 外膜蛋白A（Outer membrane protein A, Omp A） | 第19-22页 |
| 2.2.1 基本结构与功能 | 第19-20页 |
| 2.2.2 OmpA致病机制 | 第20-21页 |
| 2.2.3 免疫逃逸 | 第21页 |
| 2.2.4 OmpA在免疫中的作用 | 第21-22页 |
| 2.2.5 OmpA与噬菌体的受体识别 | 第22页 |
| 2.2.6 OmpA参与细菌耐药的形成 | 第22页 |
| 3 细菌基因敲除技术 | 第22-24页 |
| 3.1 Red重组系统 | 第22-23页 |
| 3.2 自然转化 | 第23-24页 |
| 4 本研究的目的与意义 | 第24-25页 |
| 试验一 鸭源鸡杆菌外膜蛋白A基因克隆及结构与功能分析 | 第25-34页 |
| 引言 | 第25页 |
| 1 材料与方法 | 第25-27页 |
| 1.1 菌株 | 第25-26页 |
| 1.2 主要试剂 | 第26页 |
| 1.3 主要仪器设备 | 第26页 |
| 1.4 引物设计与合成 | 第26-27页 |
| 1.5 细菌培养 | 第27页 |
| 1.6 ompA基因的克隆 | 第27页 |
| 1.7 ompA核苷酸及氨基酸序列分析 | 第27页 |
| 1.8 OmpA理化性质分析 | 第27页 |
| 1.9 OmpA信号肽及结构分析 | 第27页 |
| 1.10 OmpA B细胞抗原表位预测 | 第27页 |
| 2 结果 | 第27-32页 |
| 2.1 扩增获得ompA基因 | 第27-28页 |
| 2.2 ompA核苷酸序列特征 | 第28-29页 |
| 2.3 OmpA的氨基酸序列特征 | 第29-31页 |
| 2.4 OmpA的理化性质 | 第31页 |
| 2.5 预测出OmpA的信号肽及结构 | 第31-32页 |
| 2.6 预测出OmpA线性B细胞抗原表位 | 第32页 |
| 3 讨论 | 第32-34页 |
| 试验二 鸭源鸡杆菌外膜蛋白A的原核表达、抗原性及免疫原性鉴定 | 第34-40页 |
| 引言 | 第34页 |
| 1 材料和方法 | 第34-36页 |
| 1.1 菌株与质粒 | 第34-35页 |
| 1.2 酶及主要试剂 | 第35页 |
| 1.3 主要仪器设备 | 第35页 |
| 1.4 引物的设计与合成 | 第35页 |
| 1.5 菌株基因组的粗提 | 第35-36页 |
| 1.6 OmpA原核表达载体的构建 | 第36页 |
| 1.7 重组OmpA蛋白的原核表达纯化 | 第36页 |
| 1.8 rOmpA免疫印迹分析（Western blotting） | 第36页 |
| 1.9 兔源多克隆抗体的制备及免疫原性分析 | 第36页 |
| 2 结果 | 第36-38页 |
| 2.1 扩增获得omp A基因及重组表达载体 | 第36-37页 |
| 2.2 rOmpA获得表达与纯化 | 第37-38页 |
| 2.3 Western blotting鉴定rOmpA为特异性目的蛋白 | 第38页 |
| 2.4 OmpA具有免疫原性 | 第38页 |
| 3 讨论 | 第38-40页 |
| 试验三 鸭源鸡杆菌重组外膜蛋白A的免疫保护性研究 | 第40-45页 |
| 引言 | 第40页 |
| 1 材料和方法 | 第40-42页 |
| 1.1 材料 | 第40页 |
| 1.1.1 菌株 | 第40页 |
| 1.1.2 试剂与仪器 | 第40页 |
| 1.1.3 实验动物 | 第40页 |
| 1.2 方法 | 第40-42页 |
| 1.2.1 灭活菌的制备 | 第40-41页 |
| 1.2.2 疫苗制备 | 第41页 |
| 1.2.3 动物试验 | 第41-42页 |
| 1.2.3.1 动物免疫 | 第41页 |
| 1.2.3.2 动物血清采集与攻毒 | 第41页 |
| 1.2.3.3 PCR鉴定 | 第41页 |
| 1.2.3.4 ELISA测定小鼠血清 | 第41-42页 |
| 2 结果 | 第42-44页 |
| 2.1 制备出性状稳定疫苗 | 第42页 |
| 2.2 抗体检测 | 第42页 |
| 2.3 攻毒保护试验 | 第42-44页 |
| 2.3.1 回收细菌鉴定为G.anatis | 第42-43页 |
| 2.3.2 小鼠存活率 | 第43页 |
| 2.3.3 病理剖检 | 第43-44页 |
| 3 讨论 | 第44-45页 |
| 试验四 鸭源鸡杆菌外膜蛋白A基因缺失突变株的构建 | 第45-53页 |
| 引言 | 第45页 |
| 1 材料和方法 | 第45-48页 |
| 1.1 材料 | 第45-46页 |
| 1.1.1 菌株与质粒 | 第45页 |
| 1.1.2 主要试剂 | 第45-46页 |
| 1.1.3 主要试剂配制 | 第46页 |
| 1.2 方法 | 第46-48页 |
| 1.2.1 引物的设计与合成 | 第46-47页 |
| 1.2.2 卡那抗性盒子及上下游同源臂的扩增 | 第47页 |
| 1.2.3 重组质粒构建酶切鉴定 | 第47页 |
| 1.2.4 OmpA突变株的构建 | 第47-48页 |
| 1.2.4 突变株筛选 | 第48页 |
| 1.2.4.1 突变株的抗性及PCR鉴定 | 第48页 |
| 1.2.4.2 自然提取外膜蛋白SDS-PAGE分析 | 第48页 |
| 2 结果 | 第48-51页 |
| 2.1 扩增获得omp A基因上下游同源臂及抗性盒子 | 第48-49页 |
| 2.2 同源重组质粒pMD18-U-K-D酶切鉴定正确 | 第49-50页 |
| 2.3 鸭源鸡杆菌突变株鉴定 | 第50-51页 |
| 2.3.1 PCR鉴定为缺失突变株 | 第50页 |
| 2.3.2 突变株的SDS-PAGE鉴定 | 第50-51页 |
| 3 讨论 | 第51-53页 |
| 全文总结 | 第53-54页 |
| 参考文献 | 第54-69页 |
| Abstract | 第69-71页 |
