论文目录 | |
| 中文摘要 | 第1-6
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| Abstract | 第6-12
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| 文献综述 | 第12-23
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| 1 水稻条纹病毒的生物学特性 | 第12-17
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| · 水稻条纹叶枯病的分布与危害 | 第12
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| · 水稻条纹叶枯病的症状 | 第12
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| · 水稻条纹叶枯病的病原、寄主及传毒介体 | 第12-13
页 |
| · 水稻条纹病毒的基因组结构 | 第13
页 |
| · 水稻条纹病毒编码的蛋白及其功能 | 第13-15
页 |
| · 水稻条纹病毒的变异 | 第15-17
页 |
| 2 RNA 沉默 | 第17-23
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| · RNA 沉默简介 | 第17
页 |
| · RNA 沉默的机制 | 第17-18
页 |
| · RNA 沉默抑制子 | 第18-23
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| · 沉默抑制子的发现和种类 | 第18-20
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| · 沉默抑制子的鉴定方法 | 第20-21
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| · 农杆菌介导的瞬时表达系统鉴定抑制子 | 第20
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| · 利用病毒载体表达法鉴定抑制子 | 第20
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| · 转基因植物杂交和嫁接鉴定抑制子 | 第20-21
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| · 沉默抑制子抑制基因沉默的机制 | 第21
页 |
| · 沉默抑制子的生物技术应用 | 第21-23
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| · 提高外源蛋白的表达水平 | 第21-22
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| · 解析RNA 沉默过程 | 第22-23
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| 引言 | 第23-25
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| 材料与方法 | 第25-41
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| 1 供试材料 | 第25-26
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| · 病样来源 | 第25-26
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| · 植物材料 | 第26
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| · 菌种和载体 | 第26
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| · 酶和化学试剂 | 第26
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| · 常用缓冲溶液和培养基 | 第26
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| · 抗生素 | 第26
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| · 仪器设备 | 第26
页 |
| 2 试验方法 | 第26-41
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| · 叶片总RNA 的提取 | 第26-27
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| · 提RNA 的准备工作 | 第26-27
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| · Trizol 抽提液提取总RNA 方法 | 第27
页 |
| · cDNA 的合成 | 第27-28
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| · PCR 技术 | 第28
页 |
| · PCR 产物的克隆 | 第28-32
页 |
| · PCR 产物回收和纯化 | 第28-29
页 |
| · PCR 产物的连接 | 第29
页 |
| · 感受态细胞的制备 | 第29-30
页 |
| · Ecoli DH5α感受态细胞的少量制备（CaCl_2 法） | 第29-30
页 |
| · 农杆菌感受态细胞的少量制备 | 第30
页 |
| · 连接产物的转化 | 第30
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| · 连接产物转化大肠杆菌 | 第30
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| · 连接产物转化农杆菌（冻融法） | 第30
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| · 阳性克隆的PCR 鉴定 | 第30-31
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| · 质粒提取 | 第31-32
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| · 克隆基因的测序、分析和登录 | 第32
页 |
| · RSV CP 基因和NS3 基因的克隆 | 第32-33
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| · CP 基因的克隆 | 第32
页 |
| · CP 基因的引物设计 | 第32
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| · cDNA 合成及外壳蛋白（CP）基因的RT-PCR 扩增 | 第32
页 |
| · NS3 基因的克隆 | 第32-33
页 |
| · NS3 基因的引物设计 | 第32-33
页 |
| · NS3 基因的PCR 扩增 | 第33
页 |
| · 克隆基因的序列分析 | 第33-36
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| · NS3 基因植物表达载体的构建 | 第36-39
页 |
| · 用于局部沉默的NS3 基因植物表达载体的构建策略（图） | 第36-37
页 |
| · 用于回复试验的NS3 基因植物表达载体的构建策略（图） | 第37
页 |
| · NS3 片段的引物设计 | 第37-38
页 |
| · NS3 片段的克隆 | 第38
页 |
| · NS3 植物表达载体的构建 | 第38
页 |
| · 重组植物表达载体转入农杆菌 | 第38-39
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| · 农杆菌共浸润接种 | 第39
页 |
| · 系统沉默试验 | 第39-40
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| · 回复试验 | 第40
页 |
| · GFP 荧光观察和拍照 | 第40-41
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| 结果与分析 | 第41-51
页 |
| 1 RSV CP 基因和NS3 基因的克隆 | 第41-43
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| · RSV CP 基因的克隆 | 第41-42
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| · cDNA 合成及外壳蛋白（CP）基因的RT-PCR 扩增 | 第41
页 |
| · RSV CP 基因的克隆 | 第41-42
页 |
| · RSV NS3 基因的克隆 | 第42-43
页 |
| · cDNA 合成及NS3 基因的RT-PCR 扩增 | 第42-43
页 |
| · RSV NS3 基因的克隆 | 第43
页 |
| 2 RSV CP 基因和NS3 基因的序列分析 | 第43-47
页 |
| · CP 基因的相似性分析 | 第43-45
页 |
| · NS3 基因的相似性分析 | 第45-47
页 |
| 3 NS3 基因植物表达载体的构建 | 第47-49
页 |
| · 用于局部沉默的NS3 基因植物表达载体的构建 | 第47-48
页 |
| · 用于局部沉默的NS3 基因片段的克隆 | 第47
页 |
| · pBin-NS3 植物表达载体的构建 | 第47-48
页 |
| · 用于回复试验的NS3 基因植物表达载体的构建 | 第48-49
页 |
| · 用于回复试验的NS3 基因片段的克隆 | 第48-49
页 |
| · TRV-NS3 植物表达载体的构建 | 第49
页 |
| 4 RSV 马鞍山分离物编码的NS3 能抑制GFP 16c 本氏烟的局部沉默 | 第49-50
页 |
| 5 RSV 安徽马鞍山分离物编码的NS3 蛋白的回复试验 | 第50-51
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| 讨论 | 第51-54
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| 1 RSV CP 基因和NS3 基因的序列分析 | 第51-52
页 |
| 2 RSV 安徽马鞍山分离物编码的NS3 基因功能鉴定 | 第52-54
页 |
| 结论 | 第54-55
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| 附：草莓镶脉病毒（SVBV）外壳蛋白的原核表达及抗血清制备 | 第55-61
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| 1 材料与方法 | 第55-57
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| · 酶及生化试剂 | 第55-56
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| · 质粒载体及菌株 | 第56
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| · 引物的设计与合成 | 第56
页 |
| · SVBV 外壳蛋白基因的克隆 | 第56
页 |
| · 原核表达质粒的构建 | 第56
页 |
| · CP 在pET-32a 表达系统中的表达与纯化 | 第56
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| · 重组蛋白的多抗血清的制备 | 第56-57
页 |
| 2 结果与分析 | 第57-60
页 |
| · SVBV 外壳蛋白CP 基因的克隆和原核表达质粒的构建 | 第57
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| · 重组质粒的鉴定 | 第57-58
页 |
| · 重组蛋白的表达、纯化、SDS-PAGE 及Western-blot 分析 | 第58-59
页 |
| · 抗血清制备及效价测定 | 第59-60
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| 3 讨论 | 第60-61
页 |
| 参考文献 | 第61-68
页 |
| 附录A：常用缓冲液及培养基配方法 | 第68-73
页 |
| 附录B：常用的抗生素和激素及使用浓度 | 第73-74
页 |
| 附录C：常用化学试剂、分子生物学试剂及仪器 | 第74-76
页 |
| 附录D：本文所用的重要缩写词及中文对照 | 第76-77
页 |
| 致谢 | 第77-78
页 |
| 作者简介 | 第78页 |
