论文目录 | |
| 摘要 | 第1-4页 |
| Abstract | 第4-8页 |
| 符号缩写 | 第8-9页 |
| 第一章 绪论 | 第9-18页 |
| 1.1 氨基葡萄糖 | 第9-10页 |
| 1.1.1 GlcN的结构 | 第9页 |
| 1.1.2 GlcN的性质 | 第9页 |
| 1.1.3 GlcN的应用 | 第9-10页 |
| 1.2 GlcN的生产方法 | 第10-12页 |
| 1.2.1 化学水解法 | 第10-11页 |
| 1.2.2 微生物发酵法 | 第11-12页 |
| 1.2.3 生物转化法 | 第12页 |
| 1.3 脱乙酰酶概述 | 第12-14页 |
| 1.3.1 几丁二糖脱乙酰酶脱乙酰反应 | 第13页 |
| 1.3.2 几丁二糖脱乙酰酶的来源与种类 | 第13-14页 |
| 1.4 异源基因表达系统 | 第14-15页 |
| 1.4.1 大肠杆菌表达系统 | 第14页 |
| 1.4.2 枯草芽孢杆菌表达系统 | 第14-15页 |
| 1.4.3 影响基因异源表达的因素 | 第15页 |
| 1.5 立题意义与研究内容 | 第15-18页 |
| 1.5.1 立题意义 | 第15-16页 |
| 1.5.2 研究内容 | 第16-18页 |
| 第二章 材料与方法 | 第18-38页 |
| 2.1 实验材料 | 第18-23页 |
| 2.1.1 实验试剂 | 第18-19页 |
| 2.1.2 实验仪器和设备 | 第19-20页 |
| 2.1.3 菌株与质粒 | 第20-22页 |
| 2.1.4 主要培养基 | 第22页 |
| 2.1.5 常用溶液的配置 | 第22-23页 |
| 2.2 分子生物学操作 | 第23-24页 |
| 2.2.1 感受态的制备 | 第23页 |
| 2.2.2 质粒DNA的提取及DNA片段的回收 | 第23页 |
| 2.2.3 一步法克隆 | 第23页 |
| 2.2.4 酶切和连接 | 第23页 |
| 2.2.5 总RNA的提取及c DNA的合成 | 第23-24页 |
| 2.2.6 荧光定量PCR | 第24页 |
| 2.3 几丁二糖脱乙酰酶的异源胞内表达 | 第24-27页 |
| 2.3.1 重组质粒pET-28a-Dac的构建 | 第24-26页 |
| 2.3.2 重组质粒pET-28a-Dac的转化及重组大肠杆菌的诱导表达 | 第26页 |
| 2.3.3 重组质粒pP43NMK-Dac的构建 | 第26-27页 |
| 2.3.4 重组质粒pP43NMK-Dac的转化及重组枯草芽孢杆菌的发酵表达 | 第27页 |
| 2.4 几丁二糖脱乙酰酶的异源分泌表达 | 第27-30页 |
| 2.4.1 重组质粒pMA0911-Dac系列的构建 | 第27-29页 |
| 2.4.2 重组质粒pP43NMK-yncM-Dac的构建 | 第29-30页 |
| 2.4.3 基因N端融合N端编码序列的重组质粒构建 | 第30页 |
| 2.4.4 重组质粒的转化及重组枯草芽孢杆菌的发酵表达 | 第30页 |
| 2.5 几丁二糖脱乙酰酶的定向进化 | 第30-33页 |
| 2.5.1 计算机模拟分子对接 | 第30-31页 |
| 2.5.2 定点饱和突变及高通量筛选 | 第31-32页 |
| 2.5.3 几丁二糖脱乙酰酶的蛋白纯化 | 第32页 |
| 2.5.4 几丁二糖脱乙酰酶的动力学参数测定 | 第32-33页 |
| 2.6 生物法催化合成GlcN | 第33-35页 |
| 2.6.1 几丁二糖脱乙酰酶的最适反应pH及反应温度研究 | 第33页 |
| 2.6.2 不同温度下GlcN的稳定性研究 | 第33页 |
| 2.6.3 全细胞催化合成GlcN | 第33-34页 |
| 2.6.4 酶法脱乙酰合成GlcN | 第34-35页 |
| 2.7 检测方法及数据分析 | 第35-38页 |
| 2.7.1 HPLC分析 | 第35页 |
| 2.7.2 几丁二糖脱乙酰酶的酶活力检测方法 | 第35-36页 |
| 2.7.3 蛋白SDS-PAGE分析 | 第36-37页 |
| 2.7.4 蛋白浓度检测 | 第37页 |
| 2.7.5 数据处理与统计分析 | 第37-38页 |
| 第三章 结果与讨论 | 第38-65页 |
| 3.1 几丁二糖脱乙酰酶基因的异源胞内表达 | 第38-42页 |
| 3.1.1 重组质粒pET-28a-Dac的构建 | 第38-39页 |
| 3.1.2 重组质粒pET-28a-Dac的转化和诱导表达 | 第39-40页 |
| 3.1.3 重组质粒pP43NMK-Dac的构建 | 第40-41页 |
| 3.1.4 重组质粒pP43NMK-Dac的转化和发酵表达 | 第41-42页 |
| 3.2 几丁二糖脱乙酰酶的分泌表达 | 第42-51页 |
| 3.2.1 信号肽的筛选 | 第42-43页 |
| 3.2.2 重组质粒pP43NMK-yncM-Dac的构建及表达 | 第43-45页 |
| 3.2.3 5'非翻译区突变质粒pP43NMKmut-yncM-Dac的获得 | 第45-46页 |
| 3.2.4 5'非翻译区突变对蛋白表达的影响 | 第46-47页 |
| 3.2.5 基因Dac转录水平的分析 | 第47-49页 |
| 3.2.6 N端编码序列(NCS)对蛋白表达的影响 | 第49-51页 |
| 3.3 几丁二糖脱乙酰酶的定向进化 | 第51-55页 |
| 3.3.1 分子对接及关键位点的选择 | 第51-52页 |
| 3.3.2 定点饱和突变及高通量筛选 | 第52-53页 |
| 3.3.3 目的蛋白的纯化及比酶活的测定 | 第53-54页 |
| 3.3.4 目的蛋白的动力学分析 | 第54-55页 |
| 3.4 生物法催化合成氨基葡萄糖 | 第55-65页 |
| 3.4.1 几丁二糖脱乙酰最适pH及最适温度研究 | 第55-57页 |
| 3.4.2 GlcN的稳定性研究 | 第57-58页 |
| 3.4.3 全细胞法催化合成GlcN | 第58-61页 |
| 3.4.4 酶法脱乙酰合成GlcN | 第61-64页 |
| 3.4.5 两种生物催化法合成GlcN的比较 | 第64-65页 |
| 主要结论与展望 | 第65-67页 |
| 致谢 | 第67-68页 |
| 参考文献 | 第68-72页 |
| 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文 | 第72-73页 |
| 附录：附加材料 | 第73页 |
