农杆菌介导黄曲霉遗传转化体系的优化及突变体筛选



农杆菌介导黄曲霉遗传转化体系的优化及突变体筛选

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农杆菌介导黄曲霉遗传转化体系的优化及突变体筛选

论文目录
致谢	第1-6页
摘要	第6-7页
ABSTRACT	第7-14页
1 文献综述	第14-20页
1.1 黄曲霉概述	第14页
1.1.1 黄曲霉的生物特性及危害	第14页
1.1.2 黄曲霉毒素及其危害	第14页
1.2 农杆菌介导丝状真菌遗传转化研究的进展	第14-18页
1.2.1 农杆菌简介	第14页
1.2.2 农杆菌介导的遗传转化的分子机理	第14-15页
1.2.3 农杆菌介导丝状真菌遗传转化的过程	第15页
1.2.4 用于介导转化的农杆菌种类及常用选择性标记	第15-16页
1.2.5 影响农杆菌介导丝状真菌遗传转化的效率的因素	第16-17页
1.2.6 农杆菌介导丝状真菌遗传转化的特点	第17-18页
1.2.7 ATMT的应用	第18页
1.3 黄曲霉菌遗传转化的研究进展	第18-19页
1.4 GFP在真菌遗传转化中的应用	第19-20页
2 引言	第20-22页
2.1 本研究的目的意义	第20页
2.2 本研究的主要内容	第20-21页
2.3 研究的技术路线	第21-22页
3 材料与方法	第22-38页
3.1 供试菌株与质粒	第22页
3.2 供试培养基	第22-23页
3.3 主要试剂与酶	第23页
3.4 主要仪器设备	第23-24页
3.5 供试菌株的培养及保存	第24页
3.5.1 大肠杆菌	第24页
3.5.2 农杆菌菌株	第24页
3.5.3 黄曲霉菌	第24页
3.6 菌丝体的培养及收集	第24-25页
3.7 引物的设计	第25-26页
3.8 双元表达载体的构建	第26-27页
3.8.1 双元表达载体pDHB2的构建	第26页
3.8.2 双元表达载体pDHB/G的构建	第26-27页
3.8.3 双元表达载体pDHBG的构建	第27页
3.9 双元表达载体转入农杆菌	第27-28页
3.9.1 农杆菌感受态细胞制备	第27-28页
3.9.2 重组质粒冻融法转化农杆菌	第28页
3.10 农杆菌介导黄曲霉遗传转化体系的优化	第28页
3.11 DAPI染色及观察	第28-29页
3.12 CTAB法提基因组	第29页
3.13 转化子的分子鉴定	第29-33页
3.13.1 转化子的PCR验证	第29-30页
3.13.2 Southern杂交	第30-32页
3.13.3 Western杂交	第32-33页
3.14 转化子的荧光观测	第33页
3.15 转化子稳定性检测	第33页
3.16 转化子的表型分析及突变体筛选	第33-35页
3.16.1 转化子的生长	第33页
3.16.2 转化子孢子颜色分析	第33-34页
3.16.3 转化子产孢能力的测定	第34页
3.16.4 转化子产毒能力的测定	第34页
3.16.5 转化子侵染能力分析	第34-35页
3.17 TAIL-PCR	第35-38页
3.17.1 TAIL-PCR扩增体系	第35-36页
3.17.2 TAIL-PCR的扩增条件	第36页
3.17.3 TAIL-PCR片段的克隆	第36-38页
4 结果与分析	第38-51页
4.1 黄曲霉单核孢子分离	第38页
4.2 不同培养基对黄曲霉抗生素敏感性的影响	第38-39页
4.3 PgpdA和PtrpC启动子比较	第39-40页
4.4 农杆菌介导黄曲霉遗传转化体系的优化	第40-41页
4.4.1 共培养温度对转化效率的影响	第40页
4.4.2 共培养时间对转化效率的影响	第40页
4.4.3 黄曲霉孢子浓度对转化效率的影响	第40页
4.4.4 农杆菌浓度对转化效率的影响	第40-41页
4.5 转化子的PCR及杂交验证	第41-42页
4.6 绿色荧光蛋白转化黄曲霉菌及其表达	第42-47页
4.6.1 非融合表达载体pDHB/G的构建	第42-43页
4.6.2 融合表达载体pDHBG的构建	第43-44页
4.6.3 荧光检测	第44-45页
4.6.4 含GFP转化子的分子检测	第45-46页
4.6.5 转化子的稳定性分析	第46-47页
4.7 转化子中T-DNA插入拷贝数分析	第47页
4.8 突变体表型筛选	第47-50页
4.9 TAIL-PCR分析T-DNA插入侧翼序列	第50-51页
5 讨论	第51-53页
5.1 孢子受体对转化的影响	第51页
5.2 启动子对异源基因在黄曲霉中表达的影响	第51页
5.3 转化条件的优化	第51-52页
5.4 ble和gfp融合与非融合表达的比较	第52页
5.5 T-DNA插入拷贝数分析	第52页
5.6 关于TAIL-PCR	第52-53页
6 结论	第53-54页
7 参考文献	第54-59页
作者简介	第59页

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